Анагаах ухааны их сургууль, Мал эмнэлгийн хүрээлэн, Халдварт өвчин судлалын үндэсний төв
Халдварт өвчин судлалын Үндэсний төвийн сүүлийн Арван жилийн судалгаагаар манай улсад тениаз өвчин нь гельминтээр үүсгэгддэг өвчнүүдээс халдварлалтын байдлаараа хоёрдугаарт орж байна. Гельминт үүсгэгчтэй инвази өвчнүүд зевхөн хүнийг төдийгүй мал, амьтдыг өвчлүүлж, улс орны эдийн засагт ихээхэн хохирол учруулдаг. Гэвч тениаз, цистицеркозын тархалтыг нарийвчлан тодорхойлсон судалгааны ажил хараахан үгүй байна. Иймээс үүсгэгч нь хүнээс үхэрт, үхрээс хүнд халдварладаг энэ өвчнийг эрт оношлох, тархалтыг судлах, улмаар биологийн аргаар тэмцэх асуудал мал аж ахуй нь хөдөө аж ахуйн үндсэн салбар болсоор байгаа манай орны нөхцөлд зүй ёсоор тавигдаж байна.
Судалгааны зорилго: Дэлхийн шинжлэх ухааны энэ салбар дахь чиг хандлагын өнөөгийн түвшинд дүй шинжилгээ хийж тениаз, цистицеркозыг оношлох бэлдмэлийг бий болгоход оршино.
Судалгааны материал, арга зүй
1. Taenia saginata (T.saginata)-v\\AH биёийн эсрэгтөрөгч бэлтгэсэн нь
Т.saginata зүйлээр халдварласан хүнд фенасал (Phenasalum) уулгаж, 14 цагийн дараа 25%-ийн магни сульфата.ар туулган бааснаас хорхойг ялган, бэлэг боловсорсон үеүдийг усаар угааж, сайтар цэвэрлээд
2. 15М ариун фосфатын буфер (pH 7.2)-ээр 3 удаа угаав. Ялган авсан T.saginata-ти бэлэг боловсорсон үеийг гомогенизатор (MOULINETTE, Испани)-оор жижиглэн нэгэн жигд болгоод 1:5 харьцаагаар 0.15М-ийн фосфатын буфөр (pH 7.2) нэмж цийдүүлээд, 22 кГц- ийн давтамжтай хэт авиа (UH-50.T айланд)-аар 10 минут үйлчлүүлэв. Уг цийдмэгийг 12000 эрг/мин-д 30 минут хурилдуулаад (HITACHI CR21E, Япон) дээд шингэнийг нь авч эсрэгтөрөгч бэлтгэх анхдагч материал болгов (4),
T.saghiata-iAm биеийн эсрэгтөрөгчийн анхдагч материалыг диэтиламиноэтил (ДЭАЭ)-целлюлозын (SIGMA) царцмагт гельхромато-графийн аргаар шүүж, гарсан элюатын уургийг спектрофотометр (JASCO, Япон)-ийн 280 нм долгионы уртад хэмжиж, тахирмаг байгуулан хамгийн их уураг агуулсан элюатыг T.saginata-шн биеийн эсрэгтөрөгч болгон ашиглав (9, 12).
3. T.saginata-ти бодис солилцооны эсрэгтөрөгч бэлтгэсэн нь
T.saginata-ти бэлэг боловсроогүй үеийг сайтар цэвэрлэн 100Ед/мл пенициллин, 100 мг стрептомицин агуулсан 20 мл физиологийн уусмал, RPMI 1640, ТС- 199 орчинд хийж, 37°С-д өсгөвөрлөн 24, 48, 72, 96 цагуудад орчныг солив. Ялган авсан орчныг 1500 эрг/ мин 10 минутхурилдуулаад дээд шингэнийг эсрэгтөрөгч бэлтгэх анхдагч материал болгов. Бодис солилцооны 'эсрэгтөрөгч дэх уургийг спектрофотометрийн 280 нм долгионы уртад хэмжив. Бодис солилцооны эсрэгтөрөгчийн анхдагч материалыг диализийн хүүдий (Spectra/Por®, Канад)-д хийж, крантны ус ба нэрмэл усаар урсгаж тус бүр 24 цаг диализ хийсний дараа полиэтиленгликоль (ПЭГ) 600 (SERVA)-hhh 30%-ийн уусмалаар өтгөрүүлээд T.saginata-тн бодис солилцооны эсрэггөрөгч болгон ашиглав (7, 8).
4. T.saginata-тн эсрэгтөрөгчийн евермец чанар ба молекул жинг тодорхойлсон нь Т.saginata-ийн эсрэгтөрөгчийн молекул жинг Laemmli (1970) болбвсруулсан додецил сульфат натри- полиакриламид гель электрофорез (SDS-PAGE)-i^h аргаар тодорхойлов. T.saginata-ши эсрэгтөрөгчүүдийг додецел сульфат натри (sodium dodecyl sulfate)-^ буфер 2 меркаптоэтанолтой адил хэмжээгээр холиод гурван мин буцалгав. Царцмагийг электрофорезын аппарат (АТТО, ЯПОН)-нд байрлуулан урьдчилан бэлтгэсэн үүрэнд жишигуураг (SIGMA), эсрэгтөрөгчүүдээс тус бүр 15 мкл-ийг хийсний дараа 40 мА гүйдлийн хүчээр 90 минут үйлчлүүлсэний дараа царцмагийг нитроцеллюлозын цаасанд Towbin (1979) нарын аргаар (Immunoblot буюу Western blot гэж нэрлэдэг) буулгаад царцмаг ба нитроцеллюлозын цаасанд буусан толбыг Кумасын хөх ба амидо харын 0.1 хувийн уусмалаар будаж, үүний дараа үхрийн ийлдэсний альбумины 3 хувийн уусмал, 1:100 шингэлсэн T.saginata-ти эерэг ба сөрөг ийлдэс, пероксидазтай холбосон туулайны иммуноглобулин G-ийн эсрэг ямааны иммуноглобулиныг нитроцеллюлозын цаасанд үйлчлүүлээд уургийн толбо илрүүлэгч будгаар будаж жишиг уурагтай дүйж эсрэгтөрөгчийн молекул жин ба өвөрмөц чанарыг тогтоов (1,2). Жишиг уураг нь туулайн булчингийн 250 кДа жинтэй миозин, 116 кДа-Е.соП-ийн р-галактозидаз, 66 кДа- үхрийн ийлдэсний альбумин, 45 кДа- шувууны өндөгний овальбумин, 29 кДа-үхрийн улаан цогцосны нүүрсхүчлийн ангидрид, 20 кДа-шар буурцагны трипсин ингибитор, 14.2 кДа-үнээний сүүний а-лактальбумин, 6.5 кДа-үнээний сүүний апротини-ээс тус тус бүрдэж байв.
5. T.saginata-\A\AH эсрэгтөрөгчийн дархан ийлдсийг бэлтгэсэн нь T.saginata-тн биеийн болон бодис солилцооны эсрэгтөрөгчийг H.Fey нарын (1976) аргаар туулайд тарьж, дархлал үүсгэх замаар дархан ийлдсийг бэлтгэв. Үүний тулд r.sag/nafa-ийн биеийн болон бодис солилцооны эсрэгтөрөгчийг Фрейндийн бүрэн хүчлүүр (ФБХ)-тэй адил хэмжээгээр холиод туулайн дөрвөн хөлний сарвуун завсар тус бүр 0.25мл-ийг тарилаа. Анхны тарилтаас хойш 3 долоо хоногийн дараа биеийн болон бодис солилцооны эсрэгтөрөгч, ФБХ-ийн холимгийгтуулайн булчинд 1 мл тарив. Үүнээс гурван долоо хоногийн дараа 1 мл эсрэгтөрөгчүүдийгтуулайны судсанд тарив. Сүүлийн тарилтаас хойш 7-10 хоногийн дараа туулайны чихнээс цус авч эсрэг биетийн таньцыг шууд бус фермент холбоот урвалаар тодорхойлов (3, 11).
6. T.saginata-тн эсрэгтөрөгч дархан ийлдсийн таньцыг тодорхойлсон нь T.saginata-тн биеийн болон бодис солилцооны эсрэгтөрөгч дархан ийлдсийн таньцыг дараалан шингэлэх замаар шууд бус фермент холбоот урвалаар (ФХУ)-аар тодорхойлов. Шууд бус фермент холбоот урвалыг A.Voller нарын (1976) аргаар, хавтгай ёроолтой, 96 үүр бүхий бичил урвалын хавтанд тавилаа. 1 мл-т 1 мг уураг агуулсан T.saginata-тн эсрэгтөрөгчийг 50 тМ карбонат буфер (pH 9.6)-ээр 1:10-1:10240 хүртэл ахин дэвшлээр шингэлж хавтангийн босоо шугамын дагуух үүр болгонд шингэлэлт бүрээс 100 мкл хийж, +4°С-д 12-18 цаг байлгаад угаагч уусмал (0.1М фосфатын буферт тавин 20 (0.05%) уусгаж бэлтгэнэ)-аар 6 удаа угаагаад, өвөрмөц бус урвалаас сэргийлэх зорилгоор хавтангийн үүр бүрт 100 мкл буфер (PBS-д тосгүйжүүлсэн хуурай сүү (DIFCO)-r 3% байхаар бодож найруулсан)-ийг нэмж өгөв. Хавтанг 37°С-д 1 цаг байлгасны дараа угаагч уусмалаар дахин 6 удаа угааж, дархан ийлдсийг 0.1 М фосфатын буфер-(рН7.2-7.4)-ээр 1:10-1:1280 хүртэл шингэлээд хавтангийн хэвтээ шугамын дагуух бүх үүрэнд шингэлэлт бүрээс 100 мкл хийж, 37°С-д 1 цаг байлгасны дараа угаагч буферээр 6 удаа угаав. Дараа нь үүр бүрт ажлын тапьцаар шингэлсэн, 100 мкл туулайны igG-гийн эсрэг ямааны IgG-r пероксидазтай холбосон коньюгат (SIGMA) нэмзэд, 37°С-т 1 цаг байлгав. Хавтанг угаагч уусмалаар 6 удаа угаасны дараа 100 мкл субстрат (0.1 М нимбзгийнхүчил, 0.003% устөрөгчийн хэт исзл, 0.5 мг/мл азинодизтилбензотиазолин сулфоны хүчил (ABTS))-bir үүр бүрт хийв. Ферментийн үйлчилгээ эхлэн үүрэн дэх шингэний өнгө өөрчлөгдмөгц хавтан уншигч(ВЮ-НАО, Model 550, иЭА)-ийн 415 нм гэрлийн долгионы уртад урвалын дүнг тодорхойлон гэрлийн нягт 0.2-оос дээш үзүүлсэн үүрэн дэх эсрэг биетийг эерэг хзмээн тооцов (5,6,10).
Судалгааны дүн, хэлцэмж. T.saginata-тн биеийн эсрэгтөрөгчийн анхдагч материалыг ДЭАЭ-ийн целлюлозын царцмагт шүүхэд 1.28 мг/мл, 0.235 мг/мл, 253 мг/мл, 0.184 мг/мл уураг агуулсан 4 задраг илрэв (Зураг 1).
Зураг 1. T.saginata-тн биеийн эсрэгтөрөгчийн уургийн хэмжээ
T.saginata-ийн бэлэг боловсроогүй үеүдийн ялгаруулсан уургийн хэмжээ орчин тус бүрд харилцан адилгүй байна (Хүснэгт 1). Хүснэгт 1-ээс харахад физиологийн уусмалд бэлэг боловсроогүй үеүд нэгдэх хоногтхамгийн их.метаболит (80.2 мг/мл) ялгаруулж байгаа ба цаашидсэнэ хэмжээ буурч (21.9 мг/мл) байна. ХаринТС 199 орчинд нэгдэх
хоногт 48.9 мг/мл хүртэл метаболит ялгаруулж цаашид хэмжээ нь мөн буурч 30.1 мг/мл болжээ. Харин 3 дахь орчинд хамгийн бага 22.9-18.2 мг/мл метаболит ялгаруулсан байна. Дээрх орчнуудад ялгаруулсан уургийн хэмжээнээс үзэхэд физиологийн уусмалд хамгийн их, RPMI 1640-д хамгийн бага уураг ялгаруулжээ.
Хүснэгт 1. T.saginata-тн бодис солилцооны эсрэгтөрөгчийн уургийн хэмжээ
T.saginata-ийн бэлэг боловсроогүй үе нь дзэрх орчнуудад өсгөвөрлөхийн хэрэзр ялгаруулах бодисын хэмжээ багасч байгаа нь энэхүү орчингууд эзэн алиныг орлож чадахгүй байгааг гэрчилж байна. r.sag/nafa-ийн биеийн эсрэгтөрөгчид 6.5-220 кДа жинтэй уургийн 11, бодис солилцооны эсрэгтөрөгчүүдэд 7.5-116 кДа жинтэй уургийн 12 толбууд тус тус илрзв. T.saginata-шн биеийн болон бодис солилцооны эсрэгтөрөгчийн уургийн молекул жинг (Зураг 2) үзүүлэв.
T.saginata-ийн бэлэг боловсроогүй үе нь дзэрх орчнуудад өсгөвөрлөхийн хэрэзр ялгаруулах бодисын хэмжээ багасч байгаа нь энэхүү орчингууд эзэн алиныг орлож чадахгүй байгааг гэрчилж байна. r.sag/nafa-ийн биеийн эсрэгтөрөгчид 6.5-220 кДа жинтэй уургийн 11, бодис солилцооны эсрэгтөрөгчүүдэд 7.5-116 кДа жинтэй уургийн 12 толбууд тус тус илрзв. T.saginata-шн биеийн болон бодис солилцооны эсрэгтөрөгчийн уургийн молекул жинг (Зураг 2) үзүүлэв.
Зураг 2. Taenia saginata-тн эсрэгтөрөгчийн уургийн молекул жин
T.saginata-ийн биёийн эсрэгтөрөгчийн уургийн өвөрмөц чанарыг (Зураг 3) тодорхойлов.
Зураг 3. T.saginata-тн биеийн эсрэгтөрөгч, дархан ийлдсийн иммуноболотын урвалд ашигласан дүн
T.saginata-ийн биеийн эсрэгтөрөгчид 6.5-220 кДа жинтэй уургийн 11 толбо илэрснээс 91 ба 110 кДа жинтэй уургууд өвөрмөц биш бусад уургууд өвөрмөц байгаа нь энэхүү эсрэгтөрөгчөөр тениаз өвчнийг оношлоход бүрэн боломжтойг харуулж байна. Бидний энэхүү судалгааны дүн Strongyliodes pap/V/osus-ийн авгалдайгаар биеийн эсрэгтөрөгч, дархан ийлдэс бэлтгэн оношлогоонд хзрзп 1зх явцад уургийн өвермөц чанарыг нь тодорхойлж харьцангуй бага молекул жинтэй уургууд өвөрмсц баина гэж дүгнэсэн судлаач S.Yoshihara (1994) нарын судалгааны ажилтай тохирч байна (13). T.saginata-тн биеийн болон бодис солилцооны эсрэгтөрөгчийн цувралыг өвөрмөц дархан ийлдэстэй нь шууд бус фермент холбоот урвалаар дараалан шингэлж таньцыг шалгав (хүснэгт 3, 4). Шууд бус ФХУ-аар T.saginata-mn биеийн эсрэгтөрөгч 1:1280, дархан ийлдэс 1:320, бодис солилцооны эсрэгтөрөгч 1:1280, дархан ийлдэс 1:160 шингэлэлтэнд тус тус эерэг урвал үзүүлж байлаа. Энэхүү судалгааны ажил нь судлаач Joshua G.W.(1988), Allan J.C. (1990) нарын T.saginata-тн биеийн болон бодиссолилцооны эсрэгтөрөгч гарган авч үхрийн цистйцеркоз, хүнийтеназын оношлогооны ФХУ-д (4,7) хэрэглэж буй судалгааны ажилтай тохирч байгаа билээ.
Хүснэгт 2. Биеийн эсрэгтөрөгч ба дархан ийлдсийн таньцыг шууд бус ФХУ-аар тодорхойлсон дүн
Хүснэгт 3. Бодис солилцооны эсрэгтөрөгч ба дархан ийлдсийн таньцыг шууд бус ФХУ-аар тодорхойлсон дүн
Дүгнэлт
1. T.saginata-тн эсрэгтөрөгчийг ДЭАЭ-целлюлозын царцмагт шүүхэд 1.28 мг/мл, 0.235 мг/мл, 0.253 мг/мл, 184 мг/мл уураг агуулсан 4 задраг илрэв.
2. Т.saginata-v\v\H бэлэг боловсроогүй үө физиологийн уусмал, RPMI-1640, болон ТС-199 орчин тус бүрд харилцан адилгүй 22.9мг/мл, 48.9мг/мл, 80.2 мг/мл уураг агуулсан бодис солилцооны бүтээгдэхүүн ялгаруулж байна.
3. T.saginata-тн биеийн эсрэгтөрөгчид 6.5-220 кДа жинтэй уургийн 11, бодис солилцооны эсрэгтөрөгчүүдэд 7.5-116 кДа жинтэй 12 уургийн толбууд тус тус илрэв. Биеийн эсрэгтөрөгчийн уургийн толбоос91 баИОкДа жинтэй уургууд өвөрмөц биш байна.
4. T.sag/nate-ийн биеийн эсрэгтөрөгч 1:1280, ийлдэс 1:320, бодис солилцооны эсрэгтөрөгч 1:1280, дархан ийлдэс 1:160 шингэлэлтэнд тус тус эерэг урвал үзүүлж байлаа.
2. Зильбер.Л.А “Иммунологические мөтоды исследований”. Москва., 1967.
3. Мөнхтүвшин.Н “Дархлалын үндэс ба эмгэг” (тэргүүн дэвтэр) УБ., 1992,
4. Allan J.C, Avila G, et al “Immunodiagnosis of taeinasis by corpoantigen detection\\\\\\\\\\\\\\\" Parasitology, 1990, dec 101 pt 3:p.473-7
5. Draelants E, Hofkens E, Harding E, Brandt J, Geerts S.Development of a dot-enzyme immunoassay for the detection of circulating antigen in cattle infected with Tae¬nia saginata cysticerci Res Vet Sci. 1995 Jan; 58(1): p.99- 100
6. Harrison LJ, Sewell MM. A comparison of the en¬zyme linked immunosorbent assay and the indirect haemaggiutination technique applied to sera from cattle experimentally infected with Taenia saginata (Goeze, 1782). Vet Immunol Immunopathol. 1981 Feb;2(1): p.67- 73.
7. Joshua GW, Harrison LJ, Sewell MM. Excreted /secreted products of developing Taenia saginata metacestodes. Parasitology. 1988 Dec; 97 (Pt 3): p.477-87,
8. Joshua G.W, et al “Protein antigens in the cyst fluid of Taenia saginata cysticerci11 Parasitology, 1989, oct 99 pt2: p.265-74
9. Juan Pedro Laclette. et al “Purification of antigen B from Taenia solium Cyst cerci by Affinity to Mammalian Collagen ” Parasitology,76 (2),1990, p.273-275
10. Machnicka B, Dziemian E, Zwierz C. Detection of Taenia saginata antigens in faeces by ELISA. App! Parasitol. 1996 Jun; 37(2):. p. 1*06-10.
11. Maizels.R.M, Blaxter. M.L, Robertson.
12. D.\\\\\\\\\\\\\\\"Parasite antigens Parasite Genes\\\\\\\\\\\\\\\" New-.York Cam- bridge.1991
13. Xin Zhuan, Su and Annie.K, Prestwood “Isolation of trichineila-spesific antigens for diagnosis by gtadient monoclonal antibody affinity chromotography\\\\\\\\\\\\\\\" Parasitology,76(6),1990, p. 842-848
14. Yoshihara S. et al “Partial characterization of larval antigens of Strongyliodes papillosus by Wstern blot analy¬sis” Parasitology, 35(6), 1994, p. 273-276
