Анагаах Ухааны Хүрээлэн Хүн Судлалын Үндэсний Төв
Хүний ЭдийнТохирооны Их Цогцолборыг (Major Histocompatibility Complex- MHC) нөхцөлдүүлэгч локус нь хүннй 6-р хромосомын богино мөр дээр (6р21) 3,5 х 106 хос нуклеотидын хэмжээтэй байр эзэлдэг. Өнөөгийн байдлаар Их Цогцолборын хүрээнд 200 гаруй ген (локус) бүртгэгдээд байгаа бөгөөд эдгээр нь үндсэн 3 ангид хуваагддаг билээ (Trowsdale and Campbell, 1997).
НLА системийн (Human Leucocyte Antigens) HLA-Д HLA-B, HIAC генүүд I ангид HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP генүүд II ангид; комплиементийн системийн зарим генүүд болон хавдрын үүсвэрийг хөнөөгч бодисыг (TNF) нийлэгжүүлдэг генүүдийг HLA-системийн III ангид тус тус төрөлжүүлэн ангилдаг (Hardy, Bell et al., 1986, Carroll and Kaltzman, 1987). Сүүлийн үед зарим эрдэмтэд HLA-системийн генүүдийг
- HLA-системийн I ба II анпйн генүуд
- дархлалын хариу урвалтай холбоотой генүүд (С2, С4Д С4В, BF, TNFA, TNFB, TAP1, ТАР2, IMP2-LMP7, HSP70...)
- дархпалын хариу урвалтай холбоотой болох нь тогтоогдоогүй бусад генүүд (C4P21, valyl-tRNA synthethase...) гэсэн 3 үндсэн хэсэгт хуваах нь тохиромжтой гэж үзэж байна (Мауг, 199f)).
Xaмгийн сүүлчийн мэдээгээр (Bodmer et al., 1997)
Н1А-системийн 1 –р ангийн хүрээнд НLА-A, HLA-B, НLA-C локусуудаас гадна HLA-E, HLA-F, HLA-G, HLA-H, HLA-J, HLAK, НLА-L локусууд бүртгэгдсэн ба II ангийн хүрээнд HLA-DRA, HLA-DRB 1, HLA-DRB2, HLA-DRB3, HLA-DRB4, HLA-DRB5, HLA-DRB6, HLA-DRB7, HLA-DRB8, HLA-DRB9, HIADQA1, HLA-DQB1, HLA-DQA2, HLA-DQB2, HLA-DQB3, HLA-DOB, HLA-DMA HLADMB, HLA-DN4 HLA-DPA1, HLA-DPB1, HLA-DPA2, HLA-DPB2 локусууд тус тус бүртгэгдээд байна (зураг 1).
HLA-систем нь хүний генийн санд хамгийн өндөр полиморфизмтэй учир тогтсон нийтлэг нэршлийн асуудал маш чухал юм. 1967 онд ДЭМБ-ын харьяалалд HLA-системийн нэршлийн комиссын үйл ажиллагаа эхэлсэн бөгөөд олон улсын Ажлын Зөвлөлгөөнүүд бүрийн үр дүнд тулгуурлан нэршлийн албан ёсны шинэчлэгдсэн мэдээлэл гаргасаар ирсэн уламжлалтай.
HLA-системийн полиморфизмийг хоёр янзын төвшинд авч үздэг. Үүнд:
а. Уламжлалт аргуудаар тогтоосон полиморфизм
HLA-системийн судалгаанд уламжлалт серологийн (Terasaki and McClelland, 1964) болон эсийн өсгөврийн (Bach and Voynow, 1966; Dupont, 1980) аргуудыг хэрэглэж ирсэн бөгөөд HLA-A, -В, -С, -DR, -DQ локусуудын антигенүүд серологийн аргаар, HLA-D локусын антигенүүд холимог лимфоцнтын өсгөврийн аргаар D-гомозигот эсийн тусламжтай тус тус тодорхойлогддог байсан учнр A, В, С, DR локусуудын антнгенүүдийг SD-антигенүүд (serologically defined), D антигенүүдийг LD-антнгенүүд (lymphocyte defined) гэж ангилж байсан үе бий (Klein, 1986).
Уламжлалт аргуудаар судлагдаж 1996 оны байдлаар HLA-системийн нэршилд албан ёсоор бүртгэгдсэн HLA өвөрмөц чанаруудыг 1-р хүснэгтэд толилуулав (Bodmer et al., 1997). Өнөөгнйн байдлаар өргөн хүрээтэй өвөрмөц чанаруудыг үл тооцох юм бол HLA-A локусын хүрээнд 24, HLA-B локусыы хүрээнд 50, HLA-C локусын хүрээнд 9, HLA-DR локусын хүрээнд 17, HLA-DQ локусын хүрээнд 7 антиген тус тус бүртгэгдэод байгаа (хүснэгт 1) бегеөд эдгээр нь нийт301 HLA-A, 1276 HLA-B, 46 HLA-C, 154 HLA-DR, 29 Н LA-DQ фенотнпүүдийг тус тус бүрдүүлдгийг тооцооны үр дүн харуулж байна. HLA-A, В, С фенотипүүдийн тоо 17,7 х 106 хүрч байхад боломжийн HLA-A, В, С, DR фенотипүүдийн тоо 27 х 109 гаруй байна. HLA-DQ, HLA-DR51, HLA-DR52, HLA-DR53 антигенүүд HLA-DR локусын антигенүүдтэй маш нягт ген хоршимжийн тэнцвэрт бус тэнцвэр холбогдож удамшдаг тул HLA-системийн фенотипийн төвшинд хүчтэй нөлөөлдөггүй байна.
D-гомозигот эсүүдийн тусламжтай холимог лимфоцитын өсгөвөрт (MLC) тодорхойлогддог DW өвөрмөц чанарууд нь HLA-системийн II ангийн генүүдийн цогцолбор үйлчлэлийн үр дүнд илэрч байгаа өвөрмөц чанар бололтой (Klein, 1986). Эсийн төвшинд илрэх дараагийн нэгэн полиморф локус бол HLA-DP юм. HLA-DР антигенүүд урьдчилан мэдрэгжсэн лимфоцитуудын холимог өсгөвөрт (Primed Lymphocyte Typing-PLT) тодорхойлогддог бөгөөд өнөөгийн байдлаар нийт 6 антиген тогтоогдоод байгаа (хүснэгг 1) ба эдгээр нь нийт 22 фенотип бүрдүүлэх боломжтой юм.
б.Молекул генетикийн аргаар тогтоосон полиморфизм
Сүүлийн үед молекул биологийн аргуудыг өргөн дэлгэр хэрэглэх болсноор HLA-системийн тухай ойлголт улам гүнзгийрч нэршилтэй холбоотой эгзэгтэй асуудлууд тодорхой болж эхэлж байна. Эдгээр аргуудын тусламжтайгаар аллелуудийн олон янзын хувилбаруудыг тогтоохоос гадна серологийн болон эсийн өсгөвөрийн аргаар тодорхойлогдсон ганц өвөрмөц чанарын хүрээнд хэд хэдэн аллелиуд байгааг илрүүлэх боломжтой юм.
Рестрикцийн фрагментийн уртын полиморфизм (РФУП).
HLA-снстемнйн II ангийн генүүднйг РФУП-нйн аргаар ДНХ-нйн зонд болон рестрнкцийн ферментүүдийн тусламжтайгаар (DRB/Taql, DQB/Taql, DQB/BamHI) тодорхойлолтын 3 янзын системийг боловсруулаад байгаа ба уламжлалт аргуудаар тогтоогдсон бүх л DR, DQ, Dw антигенүүдтэй холбоотой рестрикцийн фрагментийн уртын полиморфизмийг илрүүлдэг болоод байна. (Erlich et al., 1986). Тодорхой нэгэн локуст экзон интроны харьцаа 1:9 байдаг учнр РФУП-ийн аргаар тогтвогдсон пвлнмврфнзм нь голдуу коджидгүй дараалалд багтдаг нь ойлгомжтой. Дан РФУП-ийн арга нь цаг хугацаа ихэд шаардсан ярвигтай ажиллагаатай бөгөөд полиморф аллелиудыг бүрэн илрүүлэх боломжгүй зэрэг дутагдалтай юм.
Полимеразын гинжин урвалд (ПГУ) тулгуурласан аргууд
1980-аад оны дундуур полнмеразын гинжин урвалын ид шидийг нээсэн явдал пь (Saiki et al., 1985; Mullis and Faloona, 1987) HLA-системийн I ба II ангийн генүүднйн нуклеотидуудын дарааллын судалгааг эрчимтэй явуулах хөшүүрэг болсон юм. Нуклеотидуудын дарааллыг судалснаар ГПТ-ын арга дээр тулгуурласан хялбар атлаа богино хугацаанд ихээхэн мэдээлэл олгох олон янзын аргуудыг боловсруулах боломжийг нээсэн билээ.
ПГУ-Секвенс Өвөрмөц Олигонуклеотидууд (СӨО) (SSO: Sequence-Specific Oligonucleotide) арга нь ПГУ-аар олшруулсан ДНХ-г олигопуклеотидуудын зондуудтай холбож полиморфизмийг тодорхойлдог.
Зарчмын хувьд:
Энэхүү арга нь төрөлжсөн эрлийзжүүлэлтийн (differential hybridization) (Saiki, et al., 1986; Saiki, et ah, 1989) болон төрөлжсөн холболтын (differential ligation) (Fischer, et al., 1995) аргууд гэсэн хоёр янз байдаг.
Зарим аргууд өвөрмөц зонд хэрэглэхээсээ илүү өвөрмөц праймер ашиглаж II FY явуулах зарчимд тулгуурладаг. Үүнд Аллель Өвөрмөц Олшруулалт (ASA: Allele-Specific Amplification), Секвенс Өвөрмөц Праймерын Холболт (SSP: Sequence-Specific Priming) (Olerup, Zetterquist, 1992), зэрэг аргуудыг дурьдаж болно.
Өвөрмөц зонд болон өвөрмөц праймерыг аль алнныг нь хослуулсан аргуудын олон янзын хувилбарууд сүүлийн үед ихээхэн нэвтэрч ирснээс ПГУ-РФУП, ПГУ-Дан Хэлхээннй Байгууламжийн Полиморфнзм (ДХБП) (SSCP: Single Strand Conformation Polymorphism) (Maeda et al., 1989; Bannai et al., 1994), ПГУ-Чиглэгдсэн Гетеродуплексийн Судалгаа (MFC) (DMA: (Хүснэгт 1)
Directed Heteroduplex Analysis) (Hoshino et al., 1992; Carrington et ' al.,1992), ПГУ-Микроплаишетийн эрлийзжүүлэлт (МПЭ) (MPH: Microtiter Plate Hybridization) (Kawai et al., 1994a, 19946) зэрэг аргууд нь HLA судлалд өргөн хэрэглэгдэж байгаа болно.
ПГУ дээр тулгуурласан молекул генетикнйн аргын хувилбарууд маш эрчимтэй хөгжиж байгаа ба судалгааны хосолсон аргуудын үр дүнд HLA-системийн 1 болон II ангийн генүүдийн полиморфизмийн тухай ойлголт өргөжсөөр байна.
Молекул генетикнйн аргаар юуны түрүүнд HLA-системийн II ангийн генүүд эрчимтэй судлагдсан байдаг нь нэгдүгээрт II ангийн генүүдийн судалгаа анагаах ухаанд эрхтэн шилжүүлэн суулгах практикт нэн чухал тавигдаж байсан ба II ангийн антигенүүдийн судалгааны серологийн арга техник ярвигтай байсантай холбоотой байв. 1991 онд Япон Улсад хуралдсан HLA судлалын XI Ажлын Зөвлөлгөөнөөр HLA-системийн II ангийн генүүдийн ДНХ-ийн төвшин дахь аргачлалыг үндсэндээ зүгширсэн гэж үзсэн бөгөөд 1993 оноос эхлэн I ангийн генүүдийн молекул төвшинд судлах аргуудыг боловсронгуй болгох асуудал хөндөгдөж эхэлсэн юм. Энэ салбарт хийж гүйцэтгэсэн олон улсын хамтын ажиллагааны үр дүнг 1997 онд Франц Улсад хуралдсан XII Ажлын Зөвлөлгөөнөөр нэгтгэн дүгнэсэн бөгөөд I ангийн генүүдийг судлах ПГУ-Олшруулалтанд Тэсвэртэй Мутацийн Систем (ОТМС) (ARMSPCR: Amplification Refractory Mutation System), ПГУ-Секвенс Өвөрмөц Олигонуклеотидын Зондууд (СӨОЗ) (SSOP-PCR: Sequence Specific Oligonucleotide Probes), Секвенст Тулгуурласан Тодорхойлолт (C1T) (SBT: Sequencing Based Typing) зэрэг аргуудыг боловсруулан туршиж тодорхон үр дүнд хүрсэн байпа (Tonks et al., 1997; Til anus MGJ and Eliaou, 1997).
Нуклеотидуудын дарааллын судалгаа
Молекул аргуудаар шинээр нээгдсэн аллель генүүдийг HLA-системийн нэршилд байр сууриа олоход нуклеотидуудын дарааллын судалгаа эцсийн баталгаа болж өгдөг. Жишээлбэл А2 антиген нь эдүгээ 22 янзын хувилбартай болох нь нуклеотидуудын дарааллын судалгаагаар тоггоогдоод байна. (Bodmer et al, 1997). Аллель генүүдийг ДНХ-ийн төвшинд судалж эцсийн хувилбараар нуклеотидуудын дарааллаар тогтоодог болсноос хойш нэршилд тухайн антиген байр сууриа олоогүй, бүрэн судлагдаагүй болохыг илэрхийлдэг байсан "w" (Aw3(5, Bw22) үсгийг хэрэглэх шаардлагагүй болсон ба С локусын хувьд комплементийн генүүдтэй будлихгүйн тулд, D-локус, DP-локусын хувьд эсийн өсгөврийн аргаар тодорхойлдог болохыг илэрхийлэхийн тулд "w" үсгийг хэрэглэж байхаар тогтсон байна (Bodmer et al., 1991). нyклeотидуудын дарааллын судалгаанд нийтлэг урвалж бодис (серологийн судалгаанд нийтлэг өвөрмөц ийлдсүүд, эсийн өсгөврийн судалгаанд гомозигот эсүүдийг хэрэглэдэг) ашиглах шаардлага байдаггүй учир аллелиудад дараах Ажлын Зөвлөлгөөнүүдийг хүлээлгүй дор дор нь албан ёсны нэр өгч тогтоож байх шийдвэр гаргасан юм. HLA -системийн нэршлийн 1997 оны албан ёсны мэдээгээр (Bodmer et al.,1997) HLA-A локуст 83, HLA-B локуст 186, HLA-C локуст 42, HLA-E локуст 5, HLA-G локуст мөн 7, HLA-DR локуст 223, HLA-DQ локуст 49, НLA-DP локуст 87, HLA-DМ локуст 9, TAP локуст 9 аллель генүүд нуклеотидуудын дарааллын судалгаагаар тус тус бүртгэгдээд байна. (хүснэгт 2) .
Сүүлийн үед НLA-антигенүүдийн молекул бүтцийн тухай ойлголт мөн нэлээд өргөжлөө (Strominger et al.,1981; Bjorkman et al., 1987a; 1987b; Parham et al., 1988). HLA- системийн I ангийн антигенүүд 44000 дальтон молекул жинтэй хүнд полипептид хэлхээ ба 12000 дальтон жинтэй хөнгөн хэлхээ гэсэн хоёр хэсгээс бүрддэг байна. HLA локус нь зөвхөн хүнд хэлхээг тодорхойлдог бөгөөд хөнгөн хэлхээг (Ь2-микроглобулин) тодорхойлдог локус 15-р хромосом дээр байрладаг. b2-микроглобулин мономорф байхад а гинжийг тодорхойлдог генүүд маш олон аллель генээр удамшдаг бөгөөд полиморфизм нь голдуу эсийн гадна байршилтай N төгсгөлийн хэсгийг жолооддог хоёрдугаар болон гуравдугаар экзонуудад байрладаг байна (Zemmour and Parham 1992; Bodmer et al, 1994). HLA -системийн II ангийн антигенүүд a, b гэсэн бараг ойролцоо молекул жинтэй хоёр хэсгээс бүрддэг (Peterson et al., 1972; Ploegh et al., 1981; Kaufman et al., 1984) бөгөөд DRA локусаас бусад бүх II ангийн генүүдийн полиморф хэлбэрүүд зөвхөн 2-р экзонд байрладаг байна (Marsh and Bodmer, 1992). НLA-системийн антигенүүднйн бүтцэнд иммунглобулин молекулын тогтонги хэсэгтэй төсөөтэй хэсгүүд байдаг нь HLA антнгенүүд ба иммунглобулинууд эволюци хөгжлийн явцад нэг молекулаас үүссэн байж магадгүй гэсэн санааг зүй ёсоор төрүүлж байгаа юм (Peterson etal., 1972, 1975).
2. Bach FH and VoynowNK. One-way stimulation in mixed leukocyte cultures. Sceince 1966: 153:545¬547.
3. Begovich AB and Erlich HA. HLA typing lor bone marrow transplantation. New Polymerase Chain Reaction-based methods. JAMA 1995:273:7:586-591.
4. Bjorkman PJ, Saper MA, Samraoui B, Bennett WS, Strominger JL and Wiley DC. Structure of the human class 1 histocompatibility antigen, I1LA-A2. Nature 1987a; 329: 506-512.
5. Bjorkman PJ, Saper MA, Samraoui B, Bennett WS, Strominger JL and Wiley DC. The foreign antigen binding site and T cell recognition regions of class 1 histocompatibility antigens. Nature 1987b; 329: 512
6. Bodmer JG, Marsh SGE, Albert E, et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 1990. Tissue Antigens 1991:35: 97-104.
7. Bodmer JG, Marsh SGE, Albert E, et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 1994. Tissue Antigens 1994:44:1-18
8. Bodmer JG, Marsh SGE, Albert E, et al. Nomenclature for factors of the HLA system, 1996. Hum Immunol 1997:35: 97-104.
9. Carroll MC, Kaltzman P, et al. Linkage map
of the human major histocompatibility complex in-
cluding the tumor necrosis factor genes. Proc Natl
AcadSci, USA 1987:88:8535-8539.
10. Carrington M, Miller T, White M, et al.
Typing of HLA-DQA1 and DQB1 using DNA single-
strand conformation polymorphism. Hum Immunol
1992:33:208-212.
11. Dupont B. HLA factors and bone marrow grafting. In: Burchenal JH, Oettgen HF eds. Can¬cer: Achievements, Challenges and Prospects for the 1980s. New York, NY: Grune and Stralton* 1980:683¬693.
12. Erlich HA, Sheldon EL and Horn G. HLA typing using DNA probes. Biotechnology. 1986:4:975¬981.
13. Fischer GF, Fae I, Petrasek M and Moser S. A combination of two distinct in vitro amplification procedures for DNA typing of HLA-DRB and DQB1 alleles . Vox Sang 1995:69:328-335.
14. Hardy DA, Bell JI, et al. Mapping of the Class II region of the major histocompatibility by pulsed-fielcl gel electrophoresis. Nature 1986:323:453.
15. Hoshino S, Kimura A, Fukuda Y, Dohi K and Sasazuki T. Polymerase chain reaction- single-strand conformation polymorphism analysis of polymorphism in DPA1 and DPB1 genes: a simple, economical and rapid method for histocompatibil¬ity testing. Hum Immunol. 1992:33:98-107.
16. Kaufman JF, An fire y C, et al. The Class II molecules of the human and murine major histocompatibility complex. Cell 1984:36:1-13.
17. Kawai S, Maekawajiri S, Tokunaga K, Juji T and Yamane A. A simple method of HLA-DRB typing using enzymatically amplified DNA and immobilized probes on microtiter plate.
Hum Immunol. 1994a:41:121-126.
18. Kawai S, Maekawajiri S, Tokunaga K, et al. HLA-DRB typing using PCR-MPH (microtiter plate-hybridization). MHC IRS 1 (Suppl.): 1994:121-125.
19. Klein J. The natural history of the major histocompatibility complex. New York, Wiley and Sons 1986.
20. Mayr WR. Recent advances in HLA. Vox Sanguinius 1996;70 (suppl. 3): 89-94.
21. Mae da M, Muraynama N, Ishi II, et al. A simple and rapid method for HLA-DQA1 genotyping by digestion of PCR-amplified DNA with allele specific restriction endonucleases. Tissue Antigens 1989:34:290-298.
22. Marsh SGE and Bodmer JG. HLA class II nucleotide sequences, 1992. Tissue Antigens 1992:40:229-243.
23. Mullis KB and Faloona F. Specific synthesis of DNA in vitro via polymerase catalyzed chain reaction. Methods Enzymol 1987:155:335-350.
24. Olerup 0 and Zetterquist H. HLA-DR typing by PGR amplification with sequence- specific primers (PCR-SSP) in 2 hours: an alternative to serological DR typing in clinical practice including donor- recipient matching in cadaveric transplantation. Tissue Antigens 1992:39:225-235.
25. Parham P, Lomen CE, Lawlor DA, et al. Nature of polymorphism in HLA-A, -B and -C molecules. Proc Natl Acad Sci, USA 1988:85:4005¬4009.
26. Peterson PA, Cunningham BA, Berggard I, et al. B2-microglobulin-A free immunoglobulin do¬main. Proc Natl Acad Sci, USA 1972:69:1697.
27. Peterson PA, Rask L, Sege K, et al. Evolutionary relationship between immunoglobulins and transplantation antigen. Proc Natl Acad Sci, USA 1975:72: 1612-1616
28. Ploegh HL, Orr HT, et al. Major histocompatibility antigens, the human HLA-A, -B, -C, and murine H2-K, H2-D Class 1 molecules. Cell 1981; 24: 287.
29. Saiki RK, Scharf S, Faloona F, et al. Enzymatic amplification of beta-globin genomic sequences and restriction site analvsis for diagnosis of sickle cell anemia. Science 1985:230:1350-1354.
30. Saiki RK, BugawanTL, Horn GT, Mullis KB and Erlich HA. Analysis of enzymatically amplified b-globin and HLA-DQa DNA with allele- specific oli-gonucleotide probes. Nature 1986:324:163-166.
31. Saiki RK, Walsh PS, Levenson CH and Erlich HA. Genetic analysis of amplified DNA with immobilized sequence- specific oligonucleotide probes. Proc Natl Acad Sci, USA. 1989:86:6230¬6234.
32. Strominger JL, Engelhard VH, et al. Biochemical analysis of the products of the MHC. New York; Garland Press 1981.
33. Terasaki PI and McClelland JD. Microdroplet of human serum cytotoxine. Nature 1964:204:998¬1000.
34. Tilanus MGJ and Eliaou JF. HLA Sequencing Based Typing: strategy and overview. liv.Charron etal. eds. Genetic Diversity of HLA. Functional and Medical Implications 1997 Vol.1, 237-238.
35. Tonks S, Marsh SGE, Bunce C et al. HLA Class I DNA Typing. In:Charron et al eds. Genetic Diversity of HLA. Functional and Medical Implications 1997 Vol.1, 201-215.
36. Trowsdale J and Campbell RD. The 12th International MHC map. In.Charron et al eds. Genetic Diversity of HLA. Functional and Medical Implications 1997 Vol.1, 499-504.
37. Zemmour J and Parham P. HLA class I nucleotide sequences, 1992. Tissue Antigens 1992:40:221-228.
