Ж. Хасболд П. Нямдаваа

ШУА-ийн ерөнхий ба сорилын биологийн хүрээлэн, Эрүүл ахуй, халдвар, нян судлалын улсын институт

ВЫДЕЛЕНИЕ ПСВЕРХНОСТНОГО АНТИГЕНА ВИРУСА ГЕПАТИТА В МЕТОДОМ ГЕЛЬХРОМАТОГРАФИИ

Ж- Хасболд, П. Нямдава

Разработана модификация метода очистки НВз — А§ из сыворотки крози путем гельхроматографии на Биогель А—5 м (200—400 меш) с предварительной преципи-тацией при помощи полиэтиленгликоля 6000. При использовании разработанной модификации удалось уменьшить общее ко-личество белка на 59,1% ^и увеличить специфическую активность в 62,8 раз в конеч-иом продукте п-о сравнению с исходной сывороткой.

Лейкеми өвчтэй австраль хүний цусны ийлдсэнд Б. Бламберг нарын (4) акх илрүүлсэн өвөрмөц эсрэгтөрөгч нь ийлдэст гепатитийн үед цусны ийлдсэнд байнга тодорхойлогддогийг олж тогтоосноор (20) вируст гепатитийн судглгаанд шинэ үе  эхэлсэн билээ. Цаашдын судалгаа нь Австргль эсрэгтөрөгч бол хожмоо Дейний биенцэр нэр авсан В гепатитийн ЕИрусийн (5) суперкапсидын бүрэлдэхүүний хэсэг юм гэдгийг хөдөлгөөнгүй тогтоосон тул 1977 онд ДЭХБ-ын экспертийн бүлэг уг зсрэгтөрөгчийг В гепатитийн вирусийн гадаргуугийн эсрэгтөрөгч (НВs —Аg—Нераtitis В surfase ahtigeh) гэж нэрлэх зөвлөмж гаргасныг (24) одоо нийтээр баримтлах болжээ. НВs —Аg нь  вирионы бүрэлдэхүүнд орохоос гадна дангаараа 15—25 нм хэмжээтэй 2,4—4,6х10⁶ дальтон молекул жинтэй бөмбөлөг буюу савханцар биеийг үүсгэдэг ажээ. (10)

Вируст гепатитийг ялган оношлох оношлуур бэлтгэх болон В гепатитаас сэргийлэх вакцин хийхийн тулд НВs —Аg-ийг их хэмжээгээр, цэврээр гарган авах шаардлага гардаг. В гепатитийн вирусийн бүтцийг нарийвчлан судалснаар НВs—Аg-ийн гол детерминантыг нийлэг аргаар гарган авах (7,12), уг эсрэгтөрөгчийг нийлэгжүүлэгч гепатомын эсийн өсгөвөр ашиглах (3,21), НВs —Аg-ийг хариуцсан вирусийн генийг Е.соli-д суулгах (19) зэрэг шинэ аргуудыг бичиж байгаа хэдий боловч НВs—Аg- ийг гарган авах гол эх сурвалж нь НВs—Аg агуулсан хүний цусны ийлдэс байсаар байна. НВs — Аg агуулсан хүний цусны ийлдэснээс НВs—Аg-ийг цэврээр ялгахын тулд хэт хурилдуурдах (8,14), иммунхророматографийн (11), полимержуулсан альбумин ашигласан аффин-хроматографын (18) болон полиэтиленгликолиор шат дараалан тундасжуулах (6, 15, 17) аргуудыг хэрэглэдэг байна. Сүүлийн үед судлаачид дээрх аргуудын заримыг хослуулан хэрэглэж сайн үр дүнд хүрэх болжээ. (9, 16, 22, 23)

Бид тус орны өвөрмөц нөхцөлд тохирсон НВs—Аg-ийг цэврээр ялгах арга боловсруулахын тулд уургийн молекулуудыг молекул жингээр нь ялгадаг гельхроматографийн аргын хувилбаруудыг ашиглан НBs—Аg-ийг хүний цусны ийлдэснээс цэвэрлэх цуврал туршлага хийсэн юм. Бидний боловсруулсан аргаар НВs—Аg-г харьцангуй цэврээр ялган авч болох бөгөөд эцсийн бүтээгдэхүүний цэвэршилтийн зэрэг нь бусад аргаар ялгасан НВs—Аg-тай дүйхүйц юм гэдгийг туршлагын үр дүн харуулав.

Материал, арга зүй

HBs-Ag-ийн эх үүсвэр Угтвар иммунэлектрофорезийн аргаар (13) НBs—Аg илрүүлсэн эрүүл донорын болон эрүүл эхийн эхсийн цусны ийлдсийг хэрэглэв.

Ийлдсийг туршлаганд хэрэглээгүй үед —40° С-т хадгалж байв. Полиэтилен-гликоль-оор тундасжуулах 6000 дальтон жинтэй полиэтилен-гликоль (ПЭГ)—(Sigma Chemicals Co., USA) ашиглан Внек нарын (23) боловсруулсан аргыг  хялбарчлан хэрэглэв.  Үүнд: тодорхой хэмжээний НBs—Аg эерэг ийлдсийг хэмжин  авч давсны  хүчлээр рН 4,6 болгоод; 30% ПЭГ-зэс эцсийн түвшрүүлэг 2% байхаар тооцоолон дуслаар нэмээд — 10°С-т 30 мин байлгав. Дараа нь +4°С-т 3000 хурдтай 30 мин хурилдуурдаж, тундсыг хаяад тундсын дээрх шингэн дээр эцсийн тувшрүүлэг 4,5% байхаар дахин 30% ПЭГ нэмж, — 10°С-т 30 мин байлгав. Мөн +4°С-т 3000 хурдтайгаар 30 мин хурилдуурдаж тундсын дээрх шингэнийг хаяад тундсыг ийлдсийн анхны эзлэхүүний 1/10—1/ 20-тэй тэнцэх хэмжээний нэрсэн усанд уусгав. Гарсан уусмалаас -ПЭГ ийн үлдэгдлийг G—50  Molselect (Hungery) гельд хроматографлаж салгав.

Гель-хроматограф 0,15 М NaCl-тай 0,01 М Трис-НС1 (РН 7,6) буферт тэнцвэржүүлсэн Биогель А5 м (Вio-Rad Lаdoratories Со., USА) маркийн .200—400 меш хэмжээтэй агарозин гелийг хэрэглэв. Уг гелийг 2x75 см хэмжээтэй колонконд угсарч, 1—5 мл материалыг 8 мл/цаг хурдтайгаар хроматографлав.

Фракцуудыг 40 дуслаар хураав.

Уургийн хэмжээг тодорхойлох гельхроматографын фракцуудад бол 280 нм долгионы урттай хэт ягаан туяаны шингээлтээр, бусад тохиолдолд биуретийн нийтлэг аргаар тодорхойлов.

НBs—Аg ба ийлдсийн өвөрмөц уургийг илрүүлэхдээ угтвар иммунэлектрофорез (13) болон завсрын гельтэй нийлмэл иммунэлектрофорезийн (1) аргыг хэрэглэж, хүний ийлдсийн уургуудын эсрэг гахайн эсрэг бие (SwAHu) ielfo-SERYAC, Chekoslovakia), Эрүүл ахуй, халдвар, нян судлалын улсын институтэд гарган авсан (2) НBs—Аg-ий   эсрэг ямааны эсрэг биеийг ашиглав.

ҮР ДҮН ШҮҮМЖ: Эхний цуврал туршилтыг 10⁴— 10^б молекул-жинтэй уургийн молекулуудыг өөр хоороид нь ялгах чадвартай гелиэр НBs—Аg эерэг 1,0 мл цусны ийлдсийг хроматографлаж хийв. Энэ туршлагын дүнгээс үзэхэд ийлдсийн нийт уураг 3 фракц болон салж байв. (Зураг 1). Завсрын гельтэй нийлмэл иммунэлектрофорезоор НBs—Аg-ийн тархалтыг үзэхэд 31—40 дэх фракцид буюу уургийн эхний 2 фракцийн хооронд гарч байлаа. Гэвч нэг удаагийн ялгалтанд оруулах ийлдсийн ачааллыг нэмэгдүүлэхэд НBs—Аg бүхий фракц дахь бусад уургийн хэмжээ ихэсч байсан учир энэхүү нэг шатат гель-хроматографын арга нь НBs—Аg-ийг их хэмжээгээр. гарган авахад тохиромжгүй байлаа. Тиймээс гельхроматограф хийхээс өмнө цусны ийлдсээс бусад уургийг зайлуулж, НBs—Аg -ийн хэмжээг ихэсгэх нэг шат нэмэх шаардлагатай болов.Энэ зорилгоор бид ПЭГ-ээр урьдчилан тундасжуулах аргыг (23) хэрэглэв. ПЭГ-ээр хоёр шаттайгаар тундасжуулахад туршлаганд авсан иилдэсний нийт уургийн 87% нь, нийт НBs—Аg -ийн 20% орчим нь хаягдаж, НBs—Аg -ийн өвөрмөц идэвх 6 дахин ихсэв (Хүснэгт 1).

4,5% ПЭГ-ээр тундасжуулсан фракцаас ПЭТ-ийг G—50 Моlselekt-ээр зайлуулж, Биогель А—5 м (200—400 меш) гелиэр хроматографлахад 30-43 дугаар фракцид 1: 4-1:512 (дунджаар 1 : 16) таньцтаи НBs—Аg ялгарав. (Зураг 2)

 НBs—Аg агуулсан фракцуудын нийлбэр уургийн хэмжээ 3,6 мг/мл болсон нь өмнөх шатны үургийн хэмжээнээс 30 дахин бага болжээ.

ПЭГ-ээр тундасжуулсны дараа НBs—Аg ийг гельхроматографаар цэвэрлэсэн 2 шатны ерөнхий үзүулэлтийг үзвэл (хүснэгт 2), ажилбарын явцад анх авсан сорьцын уургийн 99,1% нь хаягдаж, эцсийн бү-тээгдэхүүн дэх, НBs—Аg -ийн өвөрмөц идэвх нь 62,8 дахин өсчээ. Энэ нь НBs—Аg-ийг цэвэрлэж, өтгөрүүлсэн бусад судлаачийн үзүүлэлтээс {6, 15, 22, 23) муугүй байна.

ДҮГНЭЛТ

1. НBs—Аg эерэг хүний цусны ийлдсээс бага хэмжээний НBs—Аg-ийг гельхроматографын аргаар цэврээр ялгаж болох юм.

2. Гельхроматографаар  ялгах НBs—Аg -ийн    гарцыг нэмэгдүүлэхийн тулд ПЭГ-ээр урьдчилан тундасжуулах нь тохиромжтой.

3. ПЭГ-ээр тундасжуулсан материалаас 3 мл авч Г—50 гелиэр ПЭГ үлдэгдлээс салгахад 5 мл болтол шингэнийг   биогелиэр хроматографлахад гарсан хэмжээ.

НBs—Аg-эерэг цусны ийлдсээс гельхроматографын аргаар НBs—Аg-ийг цэвэрлэсэн нь. Зураасаар уургийн ерөнхий хэмжээг 280 нм урттай гэрлийн долгионы шингээлтээр, ташуу шугамтай дөрвөлжнөөр НBs—Аg-ийн өвөрмөц идэвхийг тус тус тэмдэглэв.

Цусны ийлдсээс ПЭТ-ээр урьдчилан өтгөрүүлсэн материалаас НBs—Аg-ийг гельхроматографаар цэвэрлэсэн нь. Зураасаар уургийн ерөнхий хэмжээг (1 : 3-иар шингэлсэн) 230 нм урттай гэрлийн долгионы шингээлтээр, ташуу зураастай дөрвөлжнөөр НBs—Аg-ийн таньцыг угтвар иммунэлектрофорезоор тодорхойлсныг тустус тэмдэглэв.