Монгол улсын ЭМЯ-ны Эрүүл ахуй халдрар нян судлалын үндэсний төв, АНУ-ын Эрүүл мэндийн Үндэсний төвийн халдварт өвчин, Харшил судлалын үндэсний хүрээлэнгийн вируст гепатитын сектор, Анагаах Ухааны Их Сургууль
Өгүүллийн PDF-ийг татах
Was determined about 40% genomic sequence of 2 strains of HBV isolated In Mongolia in Pre - S8"S"5 and "Core" regions Including main epitopes responsible for serotype, subtype and virus neutralizing specifitles and regions ImBortantJor .virus raodicaiiaa B close to...ayw2confirming the previously obtained results by sequencing In the first loop of virus neutralizing of HBsAg in 131 aminoacid position was found novel substitution asparagine to threonin not described anywere else. These 2 strains isolated in Mongolia show the many unique nucleotide and arninoacid throuhout the sequenced regions showing that HBV strains circulating in Mongolian population might have distant genotypes. pp.9-20. Picture 1. References 23
эрчимтэй нэвтэрч байгаагийн үр дүнд гепатитын В вирус (ГВВ)-ийн “С” ("core" буюу цөмийн уургийн нийлэгшил хариуцсан) генд мутаци үүсэх нь хүнд (фульминант) явцтай халдвар үусгэдэг, ”S” ("Surface" буюу уг халдварын эсрэг дархлаа тогтоох чадавхи бүхий гадаргын уургийн нийлэгшил хариуцсан) генд мутаци үүсэх нь вакцины дархлаа хамгаалж үл чадах халдварыг үүсгэдгийг олж нээхэд хүргэсэн юм (1-11).
Бидний түрүүчийн судалгаагаар (12) манайд тохиолдож буй хүнд явцтай В вируст гепатитын үед 21,7%-д нь анти-HBclgM тодорхойлогдохгүй байсныг харгалзан тэр үед ялгасан ГВВ-ын омгийн геномын нуклеотидын дарааллыг тогтоож, хэвлэлийн материалтай жишиж судлах зорилт тавьсан юм.
Судалгааны хэрэглэхдэхүүн арга хэрэглэгдэхүүн:
Халдвартын клиникийн эмнэлэг (ХКЭ)-т В Вируст гепатитын хүндэрлээр хэвтэж эмчлүүлсэн 2 өвчтөнийг авав. Лабораторын шижилгээний аргууд: Цусны биохимийн үзүүлэлтүүдийг “Рефлотрон" (Германы Boeringher Mannheim пүүоийн) аппаратаар, HBsAg, анти-HBcigM, HBcAg, анти-НВс эсрэгбиеийг АНУ-ын "Abbott” пүүсийн Фермент холбоот урвал (ФХУ)-ын цомгоор хийв.
Молекул биологийн аргууд:
Полимеразын гинжин урвал (ПГУ): Компьютерийн анализаар. Гепаднавирусийн "S", "Pre-S", "С” ба "X" гены консерватив хэсгээс давхар праймер сонгон авч полимеразын гинжин урвал (ПГУ)-аар гөпатитын В вирусийн өвөрмөц ДНХ-г олшруулав. ПГУ-ын мэдрэг чадварыг ГВВ-ийн бүтэн геном агуулсан плазмидыг ашиглан тогтооход. 3-10 ширхэг геномын хооронд хзлбэлззж байсан бөгөөд ийлдэснээс ГВВ-ийн ДНХ олшруулахад (13) зарим уед дан праймер ашиглах нь хангалттай байв.
ПГУ хийхэд "Perkin Elmer", "Stratagene", "Clontech" пүүсийн урвалж материалыг ашиглав. ПГУ-ын нэг мөчлөг нь 94 хэмд 1 мин 30 сек (ДНХ-ийн денатурацийн шат), 36-55 хэмд 1 мин 30 сек (ДНХ-ийн өвөрмөц холболтын шат), 72 хэмд 3 мин (ДНХ-ийн олшролын шат)-аас бурдэж I, II ПГУ тус бүр 25-40 мөчлөг байв.
ПГУ-ын ба нуклейн хүчлийн дараалал тогтоох праймерууд: ПГУ-ын ба секвенс хийх праймерыг "Applied Biosystems" пүүсийн ДНХ нийлэгжүүлэгч автомат машинаар буюу Жон Хопкинсын Их сургуульд захиалан бэлтгэв. Үүнд:
Eco RI ферментээр огтолсон плазмидад ПГУ-аар олшруулсан нуклейн хүчлийг оруулахын тулд дотор праймерийн хост вирусийн геномд байхгүй Eco RI огтолох сайтыг зохиомлоор оруулж өгөв. Үүнийг давхар үсгээр Eco RI огтлол дарааллыг доогуур нь зурж үзүүлэв.
Рекомбинант ДНХ
ГВВ-ийн ДНХ-г плазмидад оруулах, гэдэсний савханцрын омогт трансформаци хийх, олшруулан цзвэрлэх рекомбинант ДНХ бэлтгэх ажилбарыг :Promega G "Gsbeo BR" "Pharmacia'', "Boehringer Mannheim" цомгуудыг ашиглан стандарт аргаар (14) бэлтгэв. РUСвекторт рекомбинант ДНХ-г оруулахын тулд EcoRI фермент огтлох өвөрмөц сайтыг ПГУ-ын праймерт зохиомлоор оруулсан ба PGEM-т вектор хэрэглэснээр ингэх шаардлагагүй болсон бөгөөд ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг PGEM-T векторт шууд залгав.
Нуклейн хүчлийн нуклейтидын дараалал тогтоох (секвенс):
"US Biochemical" пүүсний "Sequenase 7 deafa DNA sequencing kit" цомгийг ашиглан дидеоксиор хэлхээг битүүлэх (Dideoxy mediated chain termination) сонгодог apraap (15) хийв. Энэ цомог нь G-C азотлог суурь ихтэй геномын хэсгийн уншилтыг тодорхой болгодог сайн талтай юм. ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг шууд секвенс хийх, эсвэл PUC, PGEM-т векторт оруулан секвенс хийх аргуудыг хэрэглэв.
Судалгаан дүн, хэлцлэг
Эмнэлзүйн төрх:
1. Өвчтөн Б.Н., эмэгтэй, 25 настай. Өвчин 3-4 хоногийн өмнө бие суларч нойрмоглох, хоолонд дургуй болох, аюулхай орчим унжирч өвдөх, дотор муухайрах, шээс өтгөрөх шинж тэмдгээр эхэлсэн. Гурван сарын өмнө Улаанбаатар хотын нэг амаржих газар хүү төрүүлсэн ба төрсний дараа тус амаржих газар судсаар шингэн сэлбүулж, тариа хийлгэж байсан гэсэн өгүүлэлтэй.
Бодит үзлэгээр: Арьс салст шар, элэг том, дэлүү тэмтрэгдэхгүй байв. Биохимийн үзүулэлтүүдийг "Рефлотрон" аппаратаар тодорхойлоход АлАТ 6750 нэгж/л, АсАТ 4950 нэгж/л, нийт билирубин 3,86 мг/дл, ФХУ-аар HBsAg эерэг, анти-HAV IgM болон анти-HCV сөрөг байсанд үндэслэн "В вируст гепатит, шартай, хүнд хэлбэр" гэсэн онош тавьсан. ХКЭ-т 49 хоног эмчлүүлээд АлАТ 1050 нэгж/л, АсАТ 860 нэгж/ л, нийт билирубин 10,1 мг/дл болж ферментүүдийн идэвх нилээд буурсан боловч нийт билирубины хэмжээ ихэсч, шар нэмэгдсэн, бүрэн эдгэрэлтгүйгээр диспансерийн хяналтанд эмнэлгээс гарсан.
2. Өвчтөн Р.Н.,эмэгтэй, 22 настай. Өвчин 7 хоногийн өмнөөс толгой өвдөх, шээс өтгөрөх, өтгөн цайх шинжээр эхэлсэн. 2-3 сарын өмнө зүүн шилбэ хугарч шохойдуулсан өгүүлэлтэй.
Бодит үзлэгээр: Өвчтөний ерөнхий байдал хүнд, арьс салст тод шар өнгөтэй, хордлого ихтэй. Элэг 1 5-2 см том, дэлүү хэвийн. Биохимийн шинжилгээгээр: АлАТ 805 нэгж/л, АсАТ 2080 нэгж/л, нийт билирубин 9,55 мг/дл. ФХУ-аар HBsAg эерэг, анти-HAVIgM ба анти-HCV сөрөг, "В вируст гепатит, цөс зогсонгишрол (холестаз)-той, хүнд хэлбэр" гэсэн эмнэлзүйн оноштой.
ХКЭ-т эмчлүүлэх явцад шар улам ихэсч, нийт билирубины хэмжээ 20 гаруй хоногийн турш байнга 12 мг/дл-ээс дээш өндөр хэмжээнд байв. 52 хоног эмчлүүлээд гарахад арьс, салстын шар буурсан боловч арилаагүй, харин хордлогын шинжүүд арилж биеийн ерөнхий байдал сайжирсан. Биохимийн узуулэлтүүд хэвийн хэмжээнд ороогүй. АлАТ 201 нэгж/л, AcAT 719 нэгж/л, нийт билирубин 4,14 мг/дл үзүүлэлттзйгөзр диспансерын хяналтанд шилжсэн.
Дээрх өвчтөнүүдэд ФХУ-аар анти-HBs, HBsAg, анти-HBclgM илрээгүй, Өвчтөний цусны ийлдэснээс ГВВ-ийн геномыг ПГУ-аар олшруулж нуклеотидын дарааллыг тогтоов.
ГВВ-ийн геномын төрх:
"S" гений 1-101 болон 244-474 дэхь нуклеотид, нийт 332 нуклеотид, "Pre-S1" гений 1-303, Pre-S2 гений 16-170 дахь 154 нуклеотид, нийт 457 нуклеотид, "С" гений 9-458 дахь 449 нуклеотид, бүгд 1238 нуклеотидын дарааллыг тогтоож нуклеотидын ба зарим тохиолдолд аминхүчлийн түвшинд анализ хийсэн нь ГВВ-ийн адил дэд хурээний геномын 38,7% болж байна.
"S" ген: "S" гений нийт 332 нуклеотидын дарааллыг тогтоосон нь 8 гений нийт 681 нуклеотидын 48,7% болж ГВВ-ийн генийн болон ийлдэс судлалын хэвшинжийг тодорхойлогч гол гол эпитопыг бүрэн хамарч байв.
Ийлдэс судлалын дэд хэвшинж
Монголд ялгасан ГВВ-ийн М13126, М13128 омгуудын гений нуклеотидын дарааллыг ГВВ-ийн мэдэгдэж буй зарим омгийнхтой харьцуулан үзүүлбэл
.jpg)
.jpg)
Одоогоор ayw1, ayw2, ayw3, syw4, ayr, adw2, adw4 гэсэн HBsAg-ний ийлдэс судлалын 8 дэд хэв шинжийг тодорхойлоод буй бөгөөд тэдгээрийг Р1-Р8 гэж дугаарласан байна. (16) мөн adr дэд хэвшинж нь q дэд хэв шинжийг (17) агуулж буй эсэхээрээ хоёр хуваагдаж adr+q os adr-q дэд хэв шинжийг үүсгэх тул одоогоор зөвхөн HBsAg-ний эдгээр 9 дэд хэвшинж байдаг хэмээн нийтээр үзэх болжээ (18).
Хүнд хэлбэрийн В гепатиттай 2 өвчтөнөөс бидний ялгасан ГВВ-ийн M13126, М13128 омгийн s генийн нуклеотидын дарааллыг тогтоосон хэсгийг эдгээр 9 дэд хэв шинжийн өвөрмөц дараалалтай харьцуулахад монголд ялгасан омгийн дараалап нь aw дэд хэвшинж, тухайлбал ayw2, ayw3-тай нийтлэг байв. Энэ нь HBsAg агуулж буй 44 донорын ийлдсэнд ГВВ-ийн хэвшинж тодорхойлох шинжилгээ хийхэд бүгд ayw байсныг нотолсон бидний өмнөх нийтлэлийн үр дунтэй тохирч байна(19). Цаашид ayw2, ayw3 дэд хэв шинжийг зааглан ялгахын тулд тогтоогдсон нуклеотидын дараалал ялгаатай байгаа хэсэгт аминхүчлийн нууцалбарыг тодорхойлов.HBsAg-ний 125 ба 127 дахь аминхүчил нь Р1, Р2, Рб-д треонин ба пролин байхад РЗ буюу ауwЗ-т метаонин ба треонин байдаг байна. Манайд ялгасан хоёр омогт хоёуланд нь 125 дахь аминхүчил нь треонин, 127 дахь аминхүчил нь пролин байна. Үүн дээр үндэслэн энэ омгуудын дэд хэвшинж нь ayw2 -той төстэй хэмээн үзлээ. Нийт тодорхойлсон 329 нуклеотидын дарааллыг жишиж үзэхэд 24 нуклеотидын ялгаа гарсан бөгөөд үүний 20 нь нуклеотид солигдсон 2 нь инсерт (нуклеотид нэмж орсон), 2 нь делеци (нуклеотид алга болсон) байв. Нийт 24 өөрчлөлтийн 15 нь дэд хэвшинж өвөрмөц (ayw). 9 нь одоо бичигдээд буй 9 дэд хэв шинжид ФД байхгуй өвермөц өөрчлөлт байв. Эдгээр 9 өвөрмөц өөрчлөлтийн 5 амин хүчлийн нууцалбарыг өөрчилсөн байна. Үүнд: 106 дахь аминхучмл (GIT —>AGT) - Валин > Метионин, 107 дахь аминхүчмл (TGT —> GTG), Цистеин — > Валин, 117 дахь аминхүчил (АЗТ —> АСС) -Метионин —> Треонин, 131 дэхь аминхучил (ААС —> АСС) -Аспарагин —> Треонин, 154 дэхь аминхүчил (АТС —> ТТС) -изолеицин — > фенилаланин болон өөрчлөгджээ.
HBsAg-ийг саармагжуулах эсрэгбие холбогдох 2 гогцоот оронзайн бүтцийн нэгдүгээр гогцоонд (аминхүчил 124-137) байгаа 131 дэхь аминхүчлийн өөрчлөлт ихээхэн сонирхолтой бөгеөд энэ нь мутант вирусийн онцлогтой төдийгүй ер нь монголд байгаа омгийн ерөнхий шинж төрхтэй ч холбоотой байж болох юм.
.jpg)
Хэрэв сүүлчийн таамаглал үнэн бол энэ өөрчлөлтийн эсрэг биед нөлөөлөх нөлөөллийг тогтоох, рекомбинант вакцин бүтээх ба рекомбинант вакцины үр дүнг тогтооход үүнийг анхааралдаа авах ёстой. Монгол ялгасан 2 омог нь “S” гений хэсэгтээ 130 дахь нуклеотидын өөрчлөлт нь аминхүчил цистейныг лейцин болгосон байв.
В гепатитын эсрэг вакцин хэрэглэж буй нутаг оронд ГВВ-ийн "Зэрлэг" омгийн HBsAg-ий 126 дахь аминхүчил изолейцин ба треонин нь серин ба аспаргинд шилжсэн, 145 дахь аминхүчил глицин нь аргининд шилжсэн (20), мөн HBsAg-ний 141 дэхь аминхүчил лизин нь глутамины хүчлээр солигдсон (21) тухай хэвлэлд бичсэн байна.
Эдгээр өөрчлөлттэй харьцуулан үзэхэд Монголд ялгасан омгийн онцлог болж буй 131 дэхь аминхүчлийн өөрчлөлт нь вакцинаас зайлсхийсэн мутаци биш харин монгол хүн амын дунд эргэлтэнд байгаа омгийн ерөнхий шинж төрхтэй холбоотой гэж үзэх үндэстэй юм. Ер нь вакцинаас зайлсхийх мутац нь хоёрдугаар гогцоонд тухайлбал 141-146 дахь аминхүчилд үүсэх хандлагатай. Энэ хэсэг нь эсрэгбие холбогдох гол эпитоп болж өгдөг. Энэ хэсгийн нуклеотид ба аминхүчлийн дараалал нь ГВВ-ийн бүх дэд хэвшинжид ихээхэн консерватив байгаа бөгөөд зөвхөн ayw4 ба adw-q дэд хүрээнд 140 дэхь аминхүчил треонин нь серинээр солигдсон байдаг. ГВВ-ийн эсрэг дархлап чиглэдэг, нийт гепаднавирусийн овгийн хамгийн консерватив хэсэг болох "S" генд манайд ялгасан энэ омгуудаас бусад дэд хэвшинжид бичигдээгүй 5 аминхүчил байгаа нь энэ омгууд нь эволюц хөгжлийн хувьд алслагдсан, ихээхэн өвөрмөц генотип агуулж байж болох юм гэсэн дүгнэлт хийх үндэслэл болж байна.
"S" гений "Pre-S" хэсэг: ГВВ-ийн гадаргын их уураг (Pre-S1), дунд уураг (Pre-S2) ба бага уураг нь ("S") ерөнхий нэг зогсох кодонтой бөгөөд өөрөөр хэлбэл гадаргын их ба дунд уураг нь нэг талдаа бага уургийг агуулна. Pre-S1 дараалалд 303 нуклеотид тодорхойлсон нь Pre-S1 дараалалд байх 357 нуклеотидын 84,8% байв. Үүнд:
.jpg)
.jpg)
ГВВ-ийн шинж тэмдэггүй тээгч, архаг идэвхтэй болон архаг тогтонги гепатиттай хүмүүст вирусийн геномын Pre-S(1), Pre-S(2) хэсэгт 2-174 нуклеотидын делеци байх нь бичигдсэн (19,20,21) боловч бидний илрүүлсэн омогт тодорхойлогдсонгүй. Pre-S(1), Pre-S(2)-т нийт 71 нуклеотидын өөрчлөлт байгаагаас 52 нь дэд хэвшинж өвөрмөц, харин 25 нь зөвхөн Монголд ялгасан омогт байгаа өөрчлөлт байв. Үүнээс зөвхөн 2 делеци, 2 инсерт тодорхойлогдсон бөгөөд бусад тохиолдолд нуклеотид солигдсон байв. Эдгээр өөрчлөлтөөс шалтгаалан нийт 20 аминхүчил Pre-S(1) хэсэгт дангаараа өөрчлөгдсөн бөгөөд үүний 11 нь делеци, инсертээс шаптгаалан уншилтын хүрээ хөдөлснөөс болсон байв. Pre-S(2) хэсэгт нийт 3 аминхүчил өөрчлөгдсөн байв.
Fre-S2 нь харыдангуй консерватив хэсэг бөгөөд ГВВ элэгний эсэд бэхлэгдэх полиальбумины рецепторын нууцалбарыг агуулдаг хэмээн таамаглаж буй хэсэгт нэг ч аминхүчлийн өөрчлөлтгүй байна.Энэ хэсгийн 9 дэхь аминхүчил нь ayw дэд хэвшинжид лейцинээр солигдсон байна. Бидний илрүүлсэн омогт энэ кодоны 3 дахь нуклеотид өөрчлөгдсөн байгаа нь урьд нь бичигдээгүй өөрчлөлт боловч аминхүчил фенилаланиныг өөрчлөөгүй байна.
"С" генд 449 нуклеотид буюу байх ёстой нуклеотидын 97,1%-ийг тодорхойлов. Үүнд:
.jpg)
Монголд ялгасан ГВВ-ийн 2 омгийн аль алинд нь байгаа, одоогоор бичигдсэн бусад ийлдэс судлалын аль ч дэд хэвшинжид байхгүй нуклеотидын өөрчлөлт 14 байгаа нь "С" ген харьцангуй консерватив шинжтэйг үзүүлж байна. Вирусийн репликацид чухал үүрэг бүхий мужууд, тухайлбал поли-А сигнал, полимеразын гений эхлэл хавиар нуклеотидын болон аминхүчлийн өөрчлөлт байхгүй байна.Эдгээр 14 өөрчлөлт нь бүгд нуклеотид солигдсон байх бөгөөд бүгдээрээ аминхүчлийг өөрчилж байв.
Монголд хүнд хэлбэрийн цочмог гепатиттай өвчтөнөөс ялгасан ГВВ-ийн 2 омог нь нуклеотидын ба аминхүчлийн түвшинд ийлдэс судлалын ayw дэд хэвшинжийн евөрмөц дарааллыг хадгалсан, бусад дэд хэвшинжид байхгуй өвөрмөц дараалалтай байгаа зэрэг нь эдгээр омог нь урьд бичигдээгүй эсрэгтөрөгчийн нийлмэл бүтэц, мөн алслагдсан сонирхолтой генотип агуулж болохыг үзүүлж байна.
2. CarmanlW.F.lJacynalM.R.,HadziyannislS.et al.(1989): Mutation preventing formation of hepatitis B \\\"e\\\" antigen in patients with chronic hepatitis B infection, Lancet.,11: 588-591;
3. Okamoto, H.,Yotsumoto,S.,Akahane,Y.et al.(1990): Hepatitis B viruses with precore region defects prevail in persistently infected hosts along with seroconversion to the antibody against \\\"e\\\" antigen, J.Virol., 64: 1298-303;
4. Tong,S.P.,Li, J.S.,Vivitski,L,Trepo,C.(1990): Active hepatitis B vi¬rus replication in the presence of anti-HBe is associated with viral variants containing an inactive pre-C region, Virology, 176: 596-603;
5. Kosaka.Y. Jakase,K.,Kojima,M.et a!.(1981): Fulminant hapatitis B: Induction by hapatitis B virus mutants defective in the precore region and incapable of encoding \\\"e\\\" antigen, Gastroenterology, 100:1087-1094;
6. Omata,M.,Ehata,T.,Yokosuka.O., et al.(1991): Mutation in the precore region of hepatitis B virus DNA in patients with fulminant and severe hepatitis, N.Engl.J.Med., 324: 1699-1704;
7. Liang,I.J.,Hasegawa,K.,Rimon,N.et al.(1991): A hepatitis B virus mutant associated with an epidemic of fulminant hepatitis, N.Engl. J.Med., 324: 1705-1709;
8. Carman,W.F.,Fagan,E.,Hadzijannis,S.et al.(1991): Assocation of a precore genomic variant of hepatitis B virus with fulminant hepatitis, Hepatology, 14: 219-222;
9. Tong,S.P., Brotman.B., Li,J.S.,et al.(1991): In vitro and in vivo replication capacity of the precore region defective hepatitis B virus vari¬ants, J.Hepatology, 13 (Suppl.4): 68-73
10. Hasegawa,K.,Huang,J.,Regers,S.A.et al.(1994): Enhanced rep¬lication of a hepatitis B virus mutant associated with a epidemic of fulminant hepatitis, J.Virology, 68(3): 1657-1659;
11. Garman,W.F.ZanetiAR,Karayinnis,P.et al.M990): Vaccine in¬duced escape mutant of hepatitis B virus. Lancet,36: 325-329.
12. Блохина,Н.П.,Алтанхуяг , М.,Алима, Д.Базаррагчаа,С. (1990); Клиническое значение анти-НВе IgM и “3” системы при остром вирусом гепатите В, В кн.: Тезисы докладов седьмой научно-практической конференции \\\"Актуальные вопросы вирусологии, Улан~Ватор с.7-9;
13. Kaneko,S.,Feinstone,S.M.,MillerlR.,(1989); Rapid and sensitive method for the detection of serum hepatitis B virus DNA using the polymerase chain reaction techinique, J.Clin.Microbiol, 9: 1930-933;
14. Sambrook.J., Fritsch,E.F.,Maniatis,T.(1989): Molecular cloning, \\\' Old Spring Harbor Laboratory Press;
15.Sanger F., Nicklen S.» Coulson A.R., (1977): Molecular cloning, Cold Spring Harbor Laboratory Press;
16. Courouce A.M., Holland P.V., Mulier J.Y., Soulier J.P., (1976): HBs antigen subtypes, Biblitheca Heaematologica, 42, 1;
17. Magnius L.O., Kaplan L, Vyas G.N., Perkins H.A., (1975): A new virus specified determinant of hepatitis B surface antigen, Acta pafhologica et microbiologica scandinavica., 83 B: 295-297;
18.TNorder,H., Hammas,B.,et al.,(1992); Comparison of the amino acid sequences of nine different serotypes of hepatitis B surface antigen and genomic classification of the corresponding hepatitis B virus strains, J.gen.Virol,73: 1201-1208;
19. Оюунбилэг, Ж.Купул.Ж.,Цацрал,Х. ба бусад.(1992). Монгол хүн амд гепатитын В,С вирусийн халдварын тархалтыг судалсандүн \\\"Вирус судлалын тулгамдсан асуудлууд\\\" онол практикийн наймдугаар бага хурал, түүвэрт, Улаанбаатар.х. 11-16;
20. Yamamoto,K.,Horikita,M.,Tsuda,F.,et al.(1994): Naturally oc¬curring ascape mutants of hepatitis B virus with various mutations in the S gene in carriers seropesitive for antibody to hepatitis B surface antigen, J.Virol. p.2671-2676;
21. Karthigesu,V.D.,Allison.LM.C.,Fortiun,M.,et al,(1994); A novel hepatitis B virus variant in the sera of immunized children, J.gen. Virol., 75: 443-448
22. Gerken,G.D.,Kremsdorf.F. Capel,M.A.et al.,(1991); Hepatitis B defective virus with rearrangements in the pre-S gene during chronic HBV infection, Virology, 183:555-565;
23. Santanio,T.,Jung,R.,Schneider,D.,et al.(1992); Hepatitis B vi¬rus genomes that cannot synthesize pre-S2 proteins occur frequently and as dominant virus population in chronic carriers in italy., Virology, 188: 948-952;
