1НЭМҮТ, 2ТҮИС-АУК, 3ТҮИСЭ-ЛАУТ
Өгүүллийн PDF-ийг татах
Enterovirus 71 (EV71) is a causative agent of hand-foot-mouth disease (HFMD). EV71 is classified into genotypes A, B and C, and genotypes B and C are further divided into B1-B5 and C1-C5 sub-genenotypes based on the VP1 gene. VP1 is the main antigen of EV71 with high immunogenicity, and may stimulate immune system to elicit specific antibody response.
A big outbreak of HFMD in Mongolia started from 2008, and EV71 was isolated in the virology laboratory of NCPH.
In order to understand the molecular epidemiology of the EV71 infection in Mongolia, eight isolates of 2008 and two of 2009 were randomly selected in this study. The RNA were extracted and the VP1 genes were amplified by RT-PCR and were performed sequencing analyzes. Phylogenetic analysis of the VP1 genes showed that all these ten EV71 isolates were classified as sub-genotype C2. When compared VP1 genes of other 15 reference C2 strains from different countries two clusters were noticed, one cluster includes strains from 1995 to 2001, and the other cluster includes those from 2006 to 2009. The VP1 genes of these Mongolian isolates are closely related with the Russian strains of 2009. The fact that the Mongolian EV71 strains were originated from Russia needs more detailed studies with more reference strains from Russia and other countries.
We have constructed than recombinant adenoviruses containing genes of EV71 and some other genes. Five constructs with different combinations were generated, containing signal peptide (SP) gene, VP1 gene, mouse immunoglobulin gamma heavy chain (Fc) gene, or cholera toxin B subunit (CT) gene. Both Fc and CT were used to enhance the immune response. After the fragments containing the target gene were inserted into transfer vector (pShuttle-CMV), the plasmids were transformed into BJ5183 and underwent homologous recombination with pAdEasy-1. All of these recombinant adenoviral vectors with five different combinations were transfected into human embryonic kidney cell (QBI-293A cell), and the recombinant adenoviruses were generated, named rADV/SP-VP-1FC-CT, rADV/SP-VP1-Fc, rAD/SP-VP1-CT rADV/SP-VP1 and rADV/Sp-Fc-CT.
After QBI-293A cells were infected by recombinant adenoviruses, we used indirect immunofluorescence assay to detect the hexon protein of adenovirus and used PCR to detect the target genes. The result showed that the five different recombinant adenovisuses and rADV/control could be detected by anti-hexon protein antibody, but the cell control not.
The expression of VP1 protein was also detected by indirect immunofluorescence assay. It demonstrated that recombinant adenoviruses with VP1 gene (rADV/SP-VP-1FC-CT, rADV/SP-VP1- Fc, rAD/SP-VP1-CT and rADV/SP-VP1) could be detected by anti-VP1 protein antibody, but rADV/ SP-Fc-CT, rADV/control and cell control not.
In order to detect the anti-VP1 protein antibody from mice, we used E.coli expression system to expess VP1 protein. And we performed Western blot to detect VP1 protein with anti-histidine antibody and sera from EV71-infected mice. And it showed that VP1 protein could be detected at the site of 40KD. Finally, we used the sera from EV71 infected and uninfected mice to detect the VP1 protein in ELISA test. Although the number of sera was limited, we still could find that the optical density values were different.
Гар, Хөл, Амны Өвчинтэй өвчтөнөөс нийт 245 сорьц (112 өтгөн, 99 хоолойн арчдас, 20 цэврүүний шингэн) цуглуулж, хүний рабдомиосаркомоос гаргаж авсан RD-A эсийн өсгөвөрт өсгөвөрлөх, ялган дүйх шинжилгээг хийв. Бүх өтгөний сорьцонд хрорформоор (1:100PBS) боловсруулалт хийж эсийн өсгөвөрт халдаасан.
Сорьц бүрийг 2-3 удаа эсийн өсгөвөрт сэлгээн өсгөвөрлөсний эцэст эс гэмтээх үйлчилгээ үзүүлсэн сорьцуудыг энтеровирүс 71, коксакивирүс А16 илрүүлэхээр саармагжуулах урвал тавив. Шинжилгээгээр 245 сорьцны 104 (42.4%) -д нь энтеровирүс илэрсэн ба үүнээс 100 (40.8%) сорьцонд хүний энтеровирүс 71, 4 (1.6%)-д нь коксакивирүс А16 тус тус илрэв.
Вирүсийн өсгөвөрийн супернатантаас QIAmp Viral RNA kit ашиглан аргачлалын дагуу вирүсийн РНХийг ялгасан. УТ-ПГУ-ийг 2 мкл pd(N)6, 2.7 мкл ddH2O, 5 мкл 10X RT буфер, 4 мкл dNTP, 3.5 мкл DMSO, 0.55 мкл RNAse ингибитор, 0,25 мкл урвуу транскриптаза, 5мкл ялгасан РНХ нийт 50мкл холимогт явуулав. ПГУ-ыг 33.8 мкл ddH2O, 5 мкл 10ХTaq буфер, 4 мкл dNTP, GeneBank-аас EV71 вирүсийн VP1 уургийн дарааллыг хайж, загварчласан EV71VP1F, EV71VP1R праймер тус бүр 1 мкл, Taq полимераза 0.2 мкл, 5мкл кДНХ нийт 50 мкл холимогт явуулсан.
ПГУ-ын нөхцөл нь 5мин 95°С-д 1 удаа, 95°С-д 30 сек, 55°С-д 3 0сек, 72°С 1 мин 35 давталттай, 72°С-т 10 мин байв. Полиомиелитийн лабораториос авч явсан 10 вирүсийн өсгөвөрт ПГУ-ын аргаар бүгд EV71 эерэг гарсан. ПГУ-ын бүтээгдэхүүнээ гель банд цэвэрлэх оношлуур GEX PCR DNA агарозын гель электрофорезоор шууд цэвэрлэв. Нуклеотидын дараалал тогтоохдоо BigDie Terminator Cycle секвенсийн оношлуур v3.1 (Applied Biosystems, Foster City, CA) ашиглан, бүтээгдэхүүнээ этанолоор тунадасжуулж цэвэрлэж, HiD формамидад (Applied Biosystems) дахин суспезлээд автомат секвенсерт оруулав (3100-Avant gemetic analyzer, Appliyed Biosystems). GeneWorks software (IntelliGenetics, Mountain View, CA) ашиглан дараалалд анализ хийхэд генотип С байв.
C генотипын дотор нарийвчлан задлаж тодорхойлоход монголд ялгасан омгууд нь бүгд C2 дэд генотипт хамаарч байв.
Бусад улс оронд ялган тодорхойлсон С2 генопитын 15 харьцуур омогтой дүйцүүлэхэд эдгээр омгууд нь 1995-2001, 2006-2009 онд ялгасан цаг хугацааны 2 бүлэг болон задарч байсан ба 2008-2009 онд ялгасан Монгол омгуудын аль аль нь ОХУ-д 2009 онд тодорхойлсон омогтой ойролцоо шинж чанартай болох нь тогтоогдов. Үүний дараа аденовирүсийг ашиглан энтеровирүс 71-ийн VP1 генийг экспресслэж хос цэнд амьд вакцин, оношлуур бүтээх судалгаа хийв.
Дохиоллын уураг (Signal peptide-SP), Vp1 уургийг кодлогч ген (Fc), ба холерын токсины В хэсгийг кодлогч генийг агуулсан 5 янзын плазмидын бүтээврийг шаттл векторт суулган(pShuttle-CMV) BJ 5183 эсийн өсгөвөрт трансформаци хийж pAd Easy-1 аденовирүсийн вектортой ижилсэх (гомологи) рекомбинаци хийв. Рекомбинант аденовирүсийн 5 янзын хослолыг бүгдийг нь хүний үр хөврөлийн бөөрний эсэд (QBI- 293A) трансфекци хийж rADV/SP-VP-1FC-CT, rADV/ SP-VP1-Fc, rAD/SP-VP1-CT rADV/SP-VP1 ба rADV/ Sp-Fc-CT рекомбинант аденовирүсийн омгуудыг гаргаж авав. Эдгээр рекомбинант омгуудыг QBI- 293A эсд халдварлуулсны дараа аденовирүсийн гексон уургийг илрүүлэхийн тулд ПГУ ашиглав. Рекомбинант аденовирүсийн 5 төрлийн хослол нь анти-гексон эсрэг бие ашигласан урвалаар илэрч байхад эсийн хяналтанд илрэхгүй байв. VP1 уургийг мөн гэдэсний савханцарын экспрессийн систем ашиглан нийлэгжүүлж, рекомбинант аденовирүсээр халдаасан хулганад VP1 уургийн эсрэгбиеийг илрүүлэв. Вестерн блот анализ хийж рекомбинант VP1-ийн хэмжээг тодорхойлоход 40КД байв. Хулганад дасгасан EV71-р халдварлуулсан хулганы цусны ийлдсийг авч фермент холбоот урвал тавихад VP1 уураг илэрч байв.
