Д.Абмэд, Д.Ану, Ж.Батаа, Д.Энхсайхан
Ticks play an important role in medicine due to their ability to transmit protozoan pathogens such as babesia. In this study we have demonstrated that polymerase chain reaction (PCR) and nested PCR methods enabled detection of Babesia microti and Babesia divergens in 126 blood samples from inhabitants who bitten by ticks and 235 adult I.persulcatus ticks from the areas where the tickborn infections are endemic. A nested PCR (Pershing et al. J Clin Microbiol Aug. 1992, 2097-2103) and PCR (Gorthert.H and Telford.R III. Am. J. Trop. Med. Hyg., 69(5), 2003, pp. 455–460) were applied for all these samples. A 154 bp fragment (18S ribosomal DNA) gene of B. microti successfully amplified products from 31blood samples and 2 I.persulcatus adult ticks while 560 bp fragment (18S ribosomal DNA) gene of B. divergens was not amplified from all samples. The first time we revealed prevalence of B.microti species in some areas of Selenge province where the tickborn infections risk is the highest. There was no evidence of B.divergens infection that is widely distributed in Eurasia among the persons and adult ticks which are involved to the study. We will do the nucleotide sequences of amplified DNA fragment of Babesia microti and compare them with other Asian countries. The nucleotide sequences data will be deposited in GenBank databases.
Mongolian Journal of Infectious Disease Research, 2011, ¹ 6(43):10-12; 1 Table, 2 Figure and 12 References
Бабезиоз нь цусны улаан эсэд шимэгчилдэг эгэл биетнээр үүсгэгддэг цочмог бөгөөд зарим тохиолдолд үхлийн аюултай өвчин юм. Өвчний шинж тэмдэг нь халуурах, бие жихүүцэх, булчин өвдөх, сульдах, мөн цус багадалттай хавсарсан шарлалттай өвчин бөгөөд хэд хоногоос хэдэн сараар илэрнэ. Хүнд өвчин үүсгэдэг хэд хэдэн зүйл тогтоогдсон. Babesi microti зүйл Америк тивд, B. divergens зүйл Европт хамгийн өргөн тохиолдоно. Резервуар нь B.microti зүйлийн хувьд мэрэгчид, B. divergens зүйлийн хувьд мал амьтад юм1. Манай оронд B.microti, B.divergens-ийн хүнд халдварласан талаарх судалгаа хийгдээгүй байгаа ба бид энэ чиглэлээр хийсэн ажлынхаа эхний үр дүнг нийтлэлээ.
Судалгааны ажлын зорилго. Сэлэнгэ аймгийн Хүдэр сум, Бугант тосгоны хачигт хазуулсан хүмүүсийн цус, ойн хачиг I.persulcatus-т B.microti, B.divergens-ийг илрүүлэх.
Судалгааны материал, аргазүй. 2011 оны VI сард Сэлэнгэ аймгийн Хүдэр сум, Бугант тосгоны хачигт хазуулсан өгүүлэмжтэй 126 хүний 5 мл цусыг EDTA бүхий вакум хуруу шилэнд авч ДНХ ялгах хүртэл -200С-т хадгалав. Эдгээрээс хүмүүсээс өндөгний цус авч, тавиур шилэн дээр түрхэц бэлтгэж, Романовский-Гимзын аргаар будаж бичил харуураар бабез илрүүлэх шинжилгээ хийв. Дурьдсан газруудын нутгаас 235 бие гүйцсэн ойн хачиг I.persulcatus-г дарцгийн аргаар түүвэрлэж, ДНХ ялгах хүртэл чийгтэй марльд ороож 40C-д амьдаар нь хадгалав. Цуснаас ДНХ-ийг ExiPerpTM 16 plus (Bioneer, Korea) автомат ялгагч машинаар, хачгаас ДНХ-г DNeasy tissue (Qiagen, Hilden, Germany) цомгоор тус тус ялгав.
Судалгаанд ашиглагдсан ПГУ-ын праймерууд болон урвалын нөхцөл
|
Үүсгэгч |
Локус |
Сикэнс (5`-3`) |
Фрагментийн хэмжээ (bp) |
Aннилин температур (0C) |
Уртасгах хугацаа (сек) |
Лавлагаа |
|
B.microti ПГУ |
18S rRNA генийн хэсэг |
CTT AGT ATA AGC TTT TAT ACA GC ATA GGT CAG AAA CTT GAA TGA TAC A |
238 |
58 |
60 |
Persing нар(1992) |
|
B.microti нэстэд ПГУ |
18S rRNA генийн хэсэг |
CAT GGT ATA GAT CCA GTA A ACA GAA TCC ATG GTA CCA GGT T |
154 |
55 |
120 |
Persing нар(1992) |
|
B.divergens |
18S rRNA генийн хэсэг |
GAACCTTAGTAATGGTTAATAGGAACG GGACGAACCTTTTTACG |
560 |
57 |
72 |
Goethert нар(2003) |
ПГУ. Праймер тус бүрийн концентраци 10 pmol. ПГУ-д Top DNA polymerase 1 U, dNTP mix (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 250 μM, Tris-HCl (pH 9.0) 10 mM, KCl 30 mM, MgCl2 1.5mM бүхий PCR premix (Bioneer AccuPower 20 ul) дээр 10 ul ДНХ, праймер тус бүр 1 ul, цэвэршүүлсэн ус 8 ul-ыг хийв. Эерэг хяналтаар 5 ul B.microti-ийн 12.3 ng/ul ДНХ, сөрөг хяналтаар 18 ul ус авлаа. ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг 5 ul ethidium bromide бүхий 1.5%-ийн агароз гельд электрофорез явуулав. Эхний ПГУ-ын бүтээгдэхүүнд дээрх праймеруудыг ашиглан үүрэн ПГУ-аар 154 bp хэмжээ бүхий өвөрмөц фрагмент олшруулахыг зорьлоо. Эхний ПГУ-ын бүтээгдэхүүн 5ul, праймер тус бүр 1ul, цэвэршүүлсэн ПГУ-ын ус 13ul PCR premix дээр нэмэв. ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг 40-т хадгалж, 1.5%-ийн агароз гель бүхий 1x TAE буферт электрофорез явуулав.
Үр дүн, хэлцэмж.
Цусны шинжилгээ: Будаж бэлтгэсэн түрхэцийг бичил харуураар шинжлэхэд нийт 91 цусанд бабез илрээгүй болно. Өвчний хурц үе, цусан дахь шимэгчийн хэмжээ их байх үед ихэвчлэн түрхэцэд бабез илэрдэг бөгөөд өвчний эхлэл үе, улаан эсийн 1% халдварлагдсан байхад бабезыг бичил харуураар оношлох боломжгүй байдаг. Эхний ПГУ-аар эерэг хяналтын сорьцоос бусад ДНХ-д 238 хос суурь фрагмент илрээгүй боловч үүрэн ПГУ-аар хачигт хазуулсан 91 хүний цусны 31 (34.0%)-т B.microti-ийн 154 хос суурь бүхий фрагмент тодорхойлогдов [Зураг 1,2].
Зураг 1. Үүрэн ПГУ-ын бүтээгдэхүүний гелийн электрофореграмм 1. М мөр: 50 хос суурь ДНХ хэмжээ заагч, 1-9-р мөр: цусны сорьцууд, N мөр:сөрөг хяналт, P мөр: B.microti-ийн 154 хос суурь бүхий эерэг хяналт.
B.microti Хойд Америк, Европын орнууд, Япон, Өмнөд Солонгос, Хятадын хойд, Тайландад тархсан2.3. ОХУ-ын Европын хэсэг, Урал, Алс дорнодод энэ үүсгэгч тохиолддог4.5.6. Манай оронд анх удаа эмгэг төрүүлэгч бабезын B.microti зүйлийн хүний халдварлалтыг тодорхойллоо. Евразийн олон газар тохиолддог B.divergens манай судалгаанд хамрагдсан хүмүүсийн цусанд хийсэн шинжилгээгээр илрээгүй болно.
Хачгийн шинжилгээ: Судалгаа хийсэн газруудаас түүвэрлэсэн 32 хачигт B.microti-ийн ДНХ илрүүлэх праймер ашиглан ПГУ-р шинжилгээ хийхэд 2 (6.25%) нь эерэг тодорхойлогдов [Зураг 2].
Зураг 2. Үүрэн ПГУ-ын бүтээгдэхүүний гелийн электрофореграмм 2. М мөр: 50 хос суурь ДНХ хэмжээ заагч, 11-17-р мөр: цусны сорьцууд, Тick 1,2-хачгийн сорьц, N мөр: сөрөг хяналт, P мөр: B.microti-ийн 154 хос суурь бүхий эерэг хяналт.
Мал эмнэлгийн судлаачид манай оронд түгээмэл тархсан билчээрийн хачигнаас B.equi (EMA-1) ба B.caballi (BC48)-ийн генийн фрагментыг илрүүлсэн байдаг7. АНУ-д B.microti-н үндсэн зөөвөрлөгч I.scapularis хачгийн халдварлалт 0.5-42% (ихэнхдээ 5-9%) байдаг. Европд үндсэн зөөвөрлөгч I. ricinus хачгийн халдварлалт, энэ хачиг тархсан өөр өөр газарт нилээд бага 0.1-16.3% байдаг2.8. ОХУ-ын Санкт-Петербург орчмоос9, Хятадын Харбины нутгаас10 түүвэрлэсэн I.persulcatus хачгаас B.microti-г илрүүлсэн байна. B.microti-ийн удамшлын хэвшинжийн олон омгууд байдаг ба ОХУ-д хүнд эмгэг төрүүлэгч B. microti “US” хэвшинж11, эмгэг төрүүлэгч бус B. microti “Munich” хэвшинж12 -ийн омгуудыг резервуар мэрэгчдээс илрүүлсэн.
Дүгнэлт.
1. Хачигт халдварын эрсдэл хамгийн өндөр байдаг Сэлэнгэ аймгийн зарим газарт бабезын B.microti зүйлийг анх удаа илрүүлэв.
2. Евразид өргөн тархсан байдаг B.divergens судалгаанд хамрагдсан хүмүүсийн цус, хачигт илрээгүй болно.
3. Манай оронд ялгасан хүнд эмгэг төрүүлэгч бабезын удамшлын хэвшинжүүдыг тогтоож, олон улсын генийн санд бүртгүүлэх ажлыг хийнэ.
Талархал.
Бидний судалгааны ажил хийхэд санхүүгийн дэмжлэг үзүүлсэн БНСУ-ын Өвчний хяналт сэргийлэлтийн төв, шинжилгээ хийхэд туслалцаа үзүүлсэн Мал эмнэлгийн хүрээлэнгийн Молекул биологийн лаборатори, ХӨСҮТ-ийн НЛА-ны бактериологи, вирүс судлалын лабораторийн хамт олонд гүн талархал илэрхийлье.
2. Homer, M.J., Aguilar-Delfin I., Telford S.R. III et al. (2000): Babesiosis. // Clin Microbiol. Rev. Vol.13. P.451-469.
3. Hunfeld K.P., Brade V. (2004): Zoonotic Babe¬sia: possibly emerging pathogens to be considered for tick-infested humans in Central Europe. Int J Med Micro¬biol. Vol. 293. Suppl 37. P. 93-103.
4. Алексеев А.Н. (2003): О возможности выявления еще одной клещевой инфекции – бабезиоза – на территории России. // Журн. Микробиол. ¹3. C. 39-43.
5. Telford S.R. III, Коренберг Э.И., Goethert H.K. (2002): Выявление в России природных очагов бабезиоза и гранулоцитарного эрлихиоза. // Журн. Микробиол.¹6. C. 21-25.
6. Alekseev A.N., Semenov A.V., Dubinina H.V. (2003): Evidence of Babesia microti infection in multi-infected Ixodes persulcatus ticks in Russia. // Exp Appl Acarol. Vol. 29. No. 3-4. P. 345-353.
7. Battsetseg B, Lucero S, Xuan X, Claveria F, By¬ambaa B, Battur B, Boldbaatar D, Batsukh Z, Khaliu¬naa T, Battsetseg G, Igarashi I, Nagasawa H, Fujisaki K. (2002): Detection of equine Babesia spp. gene fragments in Dermacentor nuttalli Olenev 1929 infesting mongo¬lian horses, and their amplification in egg and larval progenies. The Journal of Veterinary Medical Science, Aug;64(8):727-30.
8. Zintl A., Mulcahy G., Skerrett H.E. (2003): Babe¬sia divergens, a bovine blood parasite of veterinary and zoonotic importance. // Clin Microbiol Rev. Vol. 16. No. 4. P. 622–636.
9. Alekseev A.N., Semenov A.V., Dubinina H.V. (2003): Evidence of Babesia microti infection in multi¬infected Ixodes persulcatus ticks in Russia // Exp. Appl. Acarol. Vol. 29. – P. 345–353.
10. Sun Y., Liu G., Yang L. et al. (2008): Babesia microti-like rodent parasites isolated from Ixodes persul¬catus (Acari: Ixodidae) in Heilongjiang Province, China // Vet Parasitol. Vol. 156. – P. 333–339.
11. Морозов А.В., Ковалевский Ю.В., Коренберг Э.И. и др. (2006): Предварительные результаты выявления ДНК Babesia microti у мелких млекопитающих природного очага на Среднем Урале // Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. ¹ 5. – С. 136–138.
12. Ливанова Н.Н., Рар В.А., Ливанов С.Г. и др. (2005): Разнообразие паразитарных систем с участием мелких млекопитающих и Ixodes persulcatus на Северном Урале // Сиб. Экол. журн. Т. 10, ¹ 5. – С. 1079–1084.
