1,2ЭЗШУИС
Өгүүллийн PDF-ийг татах
Introduction:Saxifraga spinulosa Adams (S.spinulosa) belongs to the Saxifragaceae family and it is used for treating conjunctivitis, gynecopathy, larynx, pleural cavity in traditional Tibetan and Russian medicine. Study on antioxidant activity on this plant have also been carried out previously. However, no work has been reported on its anti-acetylcholinesterasic and anti-quorum sensing activity.
Goal: The purpose of this research was to perform phytochemical, anti-acetylcholinesterase and anti-quorum sensing activities on the extracts of aerial parts of Saxifraga spinulosa Adams.
Methods and materials: Anti-acetylcholinesterase activity was evaluated by colorimetric method. Extracts of aerial parts of S.spinulosa were tested for anti-quorum sensing activity by the Chromobacterium violaceum assay using the standard disc-diffusion method. Extracts were chromatographed with thin layer chromatography method. Phytochemical screening of crude extracts S. spinulosa Adams was carried out to detect saponins (Kokate, 1999), ferric chloride and lead acetate test was for tannin and phenolic contents and the detection of gum (Whistler, 1993) and Fehling test of carbohydrates respectively.
Results: Plant extraction and fractionation was made earlier. Acetylcholinesterase activity screening was performed on its 4 extracts, prepared from aerial parts of Saxifraga spinulosa Adams. Non-polar chloroform fraction showed more active with 45.7% compared to the aceton extract (36%), water residue (35,5%) and n-butanol fraction (37,5%). Anti-quorum sensing activity was observed with 7 extracts of S. spinulosa aerial part. From them, fractions A (21 mm), B (20 mm), C (20 mm) showed significant activity and others were moderate. No antibacterial activity (for Chromobacterium violaceum) was observed. Thin layer chromatography (TLC) fingerprinting indicated the presence of the phenolic components and flavonoids. Phytochemical screening revealed that phenolic contents, tannins, saponins, carbohydrates, gums were present in the
whole plant.
Conclusion: This study shows that, S. spinulosa has anti-acetylcholinesterase and anti-quorum sensing activity and we determined that this plant mainly contains polyphenolics compounds.
Key words: anti-quorum sensing, anti-acethylcholinesterase, Saxifraga spinulosa Adams
Судалгааны ажлын үндэслэл: Шивүүртсэрдэг (Saxifraga spinulosa Adams) нь Сэрдэгийн овогт хамаарах бөгөөд Төвөдийн уламжлалт анагаах ухаанд нүдний үрэвсэл,
эмэгтэйчүүдийн өвчинд, Оросын ардын эмнэлэгт төвөнхийн үрэвсэл, цээжний гялтангийн үрэвсэлд хэрэглэж иржээ [1]. Д. Бадрал ( 2013) нарын судлаачид Шивүүрт сэрдэг нь антиоксидант идэвх өндөртэйг тогтоосон байдаг [2]. Биологийн идэвхтэй Шивүүрт сэрдэг (S. spinulosa) ургамлын 7 ханданд ацетилхолинэстераза ферментийн идэвхийг дарангуйлах нөлөө, антикуорум сенсинг идэвхийг судлахыг зорьсон юм. Түүнчлэн дээрх ургамлын ханднуудын фитохимийн чанарын шинжилгээг хийлээ.
Судалгааны хэрэглэгдэхүүн: Бид судалгаандаа Шивүүрт сэрдэгийн газрын дээд хэсгийг 2012 оны 7-р сард Улаанбаатар хотын Налайх дүүргийн Мэлхий хадны (N=470 56.230’; E=1070 24.964’; h=1972m) орчмоос түүж бэлтгэн, ханд гарган авч ашиглав.
Судалгааны арга зүй
1. Шивүүрт сэрдэг (Saxifraga spinulosa Adams)–ийн хандны чанарын шинжилгээ
А. Шивүүрт сэрдэг (Saxifraga spinulosa Adams)-н ханданд нимгэн үеийн хроматографийн аргаар туйлтай ба туйлгүй системд чанарын шинжилгээ хийж, 5%-хүхрийн хүчил (H2SO4), 1%-natural product (NP), 5%-полиэтиленгликоль (PEG) зэрэг урвалжуудаар үйлчлэн фенолт нэгдлийг илрүүлнэ.
Б. Шивүүрт сэрдэг (Saxifraga spinulosa Adams)-н усан хандны фитохимийн чанарын шинжилгээ: Ургамлын 50 мг дээжийг 5 мл нэрмэл усанд уусгаж, 24 цагийн дараа шүүж, ханд бэлтгэнэ. Төмрийн хлоридоор фенолт нэгдлийг илрүүлэхийн тулд усан ханданд 5% төмрийн хлоридын уусмалаас 2-5 дусал нэмнэ. Усан ханданд 3мл 10%-ын хар тугалганы ацетатын уусмал нэмж, танниныг илрүүлнэ. Сапонин илрүүлэхдээ хандаа шүүж 2,5 мл-ыг нь нэрмэл усаар 10 мл болтол шингэлж, 5% -ын 50 мкл натрийн карбонатын уусмал хандандаа нэмж 30 секундын турш сэгсэрнэ. Давирхайлаг бодисыг илрүүлэхдээ усан хандан дээрээ 25 мл цэвэр этанол нэмж тогтмол хэмтэйгээр сэгсэрч үзнэ. Фехлиний аргаар нүүрс усыг тогтоохдоо Фехлиний А ба В уусмал бэлтгэн тус бүрээс нь 1 мл- ийг авч усан хандандаа нэмнэ. Фехлиний А уусмалыг 34.64 CuSO4 бага хэмжээний нэрмэл усанд уусгаж 500 мл хүртэл шингэлж бэлтгэнэ. Фехлиний В уусмалыг 50 гр натрийн гидроксидыг бага хэмжээний нэрмэл усанд уусгаж 500 мл хүртэл нэрмэл усаар шингэлж бэлтгэнэ [6]. 2. Ацетилхолинэстераза ферментийг дарангуйлах идэвхийг тогтоох Тризма буферыг бэлтгэхдээ 0,7090 гр авч 100 мл нэрмэл усанд уусгаж 4◦С-т тавина. Ацетилхолинэстереза (AChE) ферментээс 1 мг авч 0,425 мл Трисийн буферт уусгана. 0,002 гр дитиобиз2 нитробензойны хүчил (ДТНБ) –ыг авч Эппендорфын хуруу шилэнд хийж 0,5 мл буферт уусгаж бэлтгэнэ. 0,0018 гр ацетилхолин иодид (ACh) авч 0,5 мл буферт уусгана. Ургамлын дээжнээс 0,002 граммыг авч 2 мл диметилсульфоксид (ДМСО)-д уусгаж 1000 мкг/мл концентрацитай эх уусмал бэлтгэнэ. Тус уусмалыг диметилсульфоксид (ДМСО)-ээр шингэлэх замаар 100 мкл/мл, 10
мкл/мл концентрацитай уусмалууд бэлтгэнэ. Хяналтын уусмалаар физостигминыг авна. Дээжний уусмалаас 30 мкл-ийг авч 2850 мкл ДМСО, 60 мкл AChE нэмж 4◦С-т 30 минут тавина. Дараа нь 30 мкл ДТНБ, 30 мкл ACh тус тус нэмж, Эллманы боловсруулсан колориметрийн аргаар гэрлийн шингээлтийг спектрофотометрт (Shimadzu, Japan) 412 нм-ийн долгионы уртад 0,5,10 дахь минутад хэмжинэ [3,4]. Дараах томъёогоор тооцно.
.jpg)
3. Куорум сенсинг туршилт: Бид цаасан дискийн аргаар куорум сенсинг дарангуйлах идэвхийг тодорхойлов. Ариун хуруу шил бүхий 3мл хагас шингэн soft Luria Bertani Medium (LB) тэжээлт орчинд 0.002 мл ацилхомосеринлактон (AHL), 0.2 мл Chromobacterium violaceum CV026 омгийн 24 цагийн шөнийн өсгөврөөс тус тус хийн сэгсрэн хатуу тэжээлт орчин Luria Bertani Medium (LB) савласан петрийн аяганд тархаан тарина. Тарилга хийсэн агарыг царцсаны дараа 30 мг/мл концентрацитай 0.05 мл ургамлын ханд бүхий цаасан дискийг байрлуулан 270 С-д 24 цаг өсгөвөрлөж, диаметр хэмжигчээрхэмжинэ [5].
Судалгааны үр дүн, хэлцэмж
1. Шивүүрт сэрдэг (Saxifraga spinulosa Adams)–ын хандны чанарын шинжилгээ А.Нимгэн үеийн хромотографийн үр дүн: Шивүүрт сэрдэгийн газрын дээд хэсгээс гарган
авсан усан ханд, хлорформон ханд, ацетонон ханд, н-бутанолон ханд, А ханд, B ханднуудыг (1-6) систем-I болох хлороформ-метанол-ус (7:3:0,4) , систем-II буюу хлороформ-метанол (9:1)-д тус тус хроматографийг явуулан, 1%- natural product (NP), 5%-полиэтиленгликоль (PEG), 5%-хүхрийн хүчил (H2SO4) зэрэг урвалжуудаар үйлчилсэн бөгөөд хроматограммыг (Зураг 1)-д харуулав.
.jpg)
Зураг 1-ээс харахад хлороформ-метанол- ус (7:3:0,4) системд стандарт бодис (Rf=0.86) кверцетинтэй ижил бор шар өнгийн толбо ацетонон ханданд, хлороформ-метанол (9:1) системд стандарт бодис болох рутинтэй (Rf=0.4) төстэй шар өнгийн толбо н-бутанолон ханданд илэрч байна.
Б. Шивүүрт сэрдэг (Saxifraga spinulosa Adams) ургамлын усан хандны фитохимийн чанарын шинжилгээний үр дүн: Усан ханданд 5%-ийн төмрийн хлоридын уусмалаас 2-5 дусал нэмэхэд уусмалын өнгө гүн хар ногоон болж байгаа нь фенолт нэгдэл байгааг харуулж байна. Усан ханданд 3мл 10%-ийн хар тугалганы ацетатын уусмал нэмэхэд фенолт нэгдлүүдийн оролцоотойгоор цагаан, саарал өнгийн тунадас буусан байв. Хөөсрүүлэх аргаар туршилт явуулахад 2 см хөөс үүсэж, сапонин илэрсэн. Усан хандан дээрээ 25 мл цэвэр этанол нэмж тогтмол хэмтэйгээр сэгсрэхэд цагаан өнгийн тунадас үүсэж, давирхайлаг бодистой нь тогтоогдсон. Фехлиний аргаар шалгахад ханданд улаан өнгө үүсэж, нүүрс ус байгаа нь илэрлээ. 2. Шивүүрт сэрдэгийн хандны ацетилхолинэстереза ферментийн идэвхийг дарангуйлсан үр дүн Альцгеймерийн өвчин нь ихэвчлэн өндөр настай хүмүүсийн дунд тохиолддог ба эсийн холинэргийн мэдрэл дамжуулах үйл ажиллагаа алдагдсанаар ой санамж муудах, сэтгэх чадвар буурдаг бөгөөд уг өвчний эмчилгээнд ацетилхолинэстеразын идэвхийг дарангуйлах идэвхтэй бодисыг хэрэглэдэг [4]. Шивүүрт сэрдэгийн хандны ацетилхолинэстереза ферментийн идэвхийг дарангуйлсан үр дүнг хүснэгт 1-д харуулав.
Хүснэгт 1. Шивүүрт сэрдэгийн хандны ацетилхолинэстереза ферментийн идэвхийг дарангуйлсан үр дүн Тайлбар: өндөр идэвхтэй > 30% , дунд зэрэг идэвхтэй 20-30%, сул идэвхтэй < 20 %
.jpg)
Туршилтын дүнгээс харахад хлороформон ханд нь 1000 мкг/мл концентрацидаа ацетилхолинэстереза ферментийг дарангуйлах идэвх хамгийн өндөр буюу 45.7% байсан бөгөөд усан ханд 35,5%, ацетонон ханд 36%, н-бутанолон ханд 37,45% тус тус дарангуйлж байлаа.
3. Куорум сенсинг туршилтын үр дүн: Chromobacterium violaceum CV026 омог нь ацилхомосеринлактон (AHL)-ээр өдөөгдөн хөх ягаан өнгөтэй виолацин хэмээх антибиотик нийлэгжүүлдэг бөгөөд куорум сенсинг дарангуйлах идэвхитэй үед пигментийн хөх ягаан өнгө нь бүдгэрсэн хүрээ үзүүлдэг. Шивүүрт сэрдэг (Saxifraga spinulosa Adams) ургамлын ханднуудыг этанолд уусган 30 мг/ мл концентрациар бэлтгэж куорум сенсинг дарангуйлах идэвхийг шалгаж үр дүнг (Зураг 2)-д үзүүлэв.
.jpg)
Зураг 2-т А ханд-21 мм, В ханд-20 мм, С ханд-20 мм, н-бутанолон ханд-19 мм, ацетонон ханд-18 мм, хлороформон ханд-17 мм, усанд ханд-15 мм хүрээ үүссэн байгааг харуулав.
.jpg)
Зураг 3 Ханднуудын өндөр идэвхитэй анти куорум сенсингийн үр дүн Туршилтын дүнгээс харахад А ханд-21 мм буюу хамгийн их, харин В болон С ханд тус тус 20 мм хүрээ үүсгэсэн байв.
Дүгнэлт
Энэхүү судалгаагаар Шивүүрт сэрдэгийн хлороформон ханд нь 1000 мкг/мл концентрацидаа ацетилхолинэстереза ферментийн идэвхийг дарангуйлах үйлчлэл өндөр (45.7%), А ханд (21 мм) нь куорум сенсинг идэвхээр илүү байгааг тогтоов. Антикуорум сенсинг идэвх нь уг ургамалд агуулагдах фенолт нэгдэлтэй холбоотойгоор илэрч байж болох юм гэсэн дүгнэлтэнд хүрлээ.
2. Д. Бадрал, Б. Мөнгөншагай, А. Н. Брантнер, Ж. Батхүү. Шивүүрт сэрдэг (Saxifraga spinulosa Adams)-н хандны антиоксидант идэвхийн болон фитохимийн судалгааны дүнгээс. “ Монголын Эм Зүй, Эм Судлал” сэтгүүл, 2014(1) 4, 11-15.
3. Жаал Ц , Мөнгөнцэцэг Б, Батхүү Ж. “Монгол орны зарим эмийн ургамлын ацетилхолинэстераза ферментийн идэвхийг дарангуйлах үйлчлэлийг судалсан нь” Монголын анагаан ухаан №1 2010. 26-28.
4. Ellman G L, Courtney K D, Andress V, Feater-Stone R M.A new and rapid colorimetric determination of acetylcholinesterase activity. Biochem. Pharmacol. 1961, 7, 88-95
5. McClean K.H, Winson M.K, Fish L, Taylor A, Chhabra, S.R, Camara M, Daykin M, Lamb J.H, Swift S, Brcroft B.W, Stewart G.S, Williams P, Quorum sensing and
Chromobacterium violaceum: Exploitation of violacein production and inhibition for the detection of N-acylhomoserine lactone. Microbiology 1997, 143, 3703- 3711
6. Mohd Yousuf Malla, Manik Sharma, RC Saxena, Mohd Iqubal Mir, Abrar Hussain Mir and Showkat Hussain Bhat “Phytochemical Screening and Spectroscopic Determination of Total Phenolic and Flavonoid Contents of Eclipta Alba Linn. Nat. Prod. Plant Resource. 2013,3 (2):86-91
