Хадхүү.Б

Ретикулоцитыг шинжлэх нь эритропоэзийн идэвхийг үнэлэх гематологийн үндсэн тест юм.  Энэ шинжилгээг анемийн оношлогоо, ангилал ба эмчилгээний хяналтанд хэрэглэхээс гадна химийн эмчилгээ, ясны чөмөг юмуу гемапоэтик ууган эс шилжүүлэн суулгах болон  рекомбинант эритропоэтин эмчилгээний үр дүнг хянахад ашиглана.

Ретикулоцит нь гүйцэд боловсроогүй залуу эритроцит бөгөөд РНК-ийн үлдэцтэй, нормобластууд цөмөө алдсаны дараа үүсдэг эсүүд юм. Анх Эрб 1865 онд зарим эритроцитийн дотор өөр бүтэц байгааг нээсэн бөгөөд 1881 онд Эрлих ийм төрлийн эсийг ретикулофиламентоз эс гэж нэрлэсэн юм. Hawes J.B. 1909 онд, Key J.A 1921 онд цусны түрхцийг Романовский-Гимзийн будгаар будахад зарим эритроцитууд өөр өнгөтэй болдгийг илрүүлсэн бөгөөд бэхжүүлэхгүйгээр шингэн будгаар будаж шууд микроскопоор харахад (суправитал будалт) ретикулын торлог бүтэц нь морфологийн үндсэн шалгуур болдог.

Эритропоэзийн физиологи

Эритройд эгнээний эсийн хөгжил нь ясны чөмгөнд явагдах бөгөөд түүний ялгаран хөгжих, бойжих явц нь бүтцийн болон үйл ажиллагааны өвөрмөц төрөлжилтийг нөхцөлдүүлдэг. Эритроцитийн урьдал эс нь эритропоэзийн бурст үүсгэгч нэгж (Э-БҮН) бөгөөд эритропоэтин (ЭП) ба эритропоэзийн колони үүсгэгч нэгжийн (Э-КҮН)  үйлчлэлд бага мэдрэг боловч дан  ЭП-д дээд зэргийн мэдрэг байдлаараа ялгагддаг. Сонгогдсон эритропоэзийн урьдал эсүүд нь гемапоэтик ууган эсүүдээс тэдгээрийн 5-10 удаа хуваагдсаны дүнд үүснэ.  Морфологийн хувьд танигдахуйц эритроцитийн эгнээний анхны эс нь проэритробласт (эритробласт) юм. Цаашдаа ялгаран хөгжих явцад базофиль, полихроматофиль ба оксифиль эритрокариоцитууд үүсдэг (Зураг 1).  Бүхэлдээ эритробластаас эхлээд эритроцит хүртэл  эритройд эсийн ялгаран хөгжилт ба бойжилт нь 9-14 хоног үргэлжлэх ба шаардлагатай хэмжээний эндоген ЭП-ийн үйлчлэлээр хэрэгжих бөгөөд ЭП хүрэлцэхгүй бол үхэлд (апоптоз) хүргэнэ. ЭП-ийн үйлчлэл нь өвөрмөц ЭП-рецепторын нөлөөлөл дор явагдах бөгөөд тэдгээр нь Э-КҮН эс, проэритробласт ба базофиль эритроцит эсүүдэд хамгийн ихээр агуулагдана. Эритропоэзийн зохицуулгад витамин В-12, фолийн хүчил микроэлементүүд (төмөр, зэс) чухал үүрэг гүйцэтгэнэ. 

Эритрокариоцитын 5-10% нь хэтэрхий хурдан гемаглобин нийлэгшүүлэх чадвартай бөгөөд эдгээр нь G₂ фазын үед 27 пг-аас дээш гемоглобин  нийлэгжүүлснээр өөрийнхөө ялгаран хөгжилтийг зогсоож улмаар ясны чөмгөнд байхдаа үхэж устдаг. Энэ хэлбэрийн эритропоэзийг үр дүнгүй эритропоэз гэж нэрлэнэ. Энэ нь эритроцитын үүсэлтийг зохицуулж  эритроцитийн хэрэгцээ байнга өөрчлөглөж байх нөхцөлд эритроны тогтолцооны тэнцвэрийг хадгалах нөхцөл бүрдүүлдэг. Ялангуяа эмгэг өвчний үед эритройд эсийн ялгаран хөгжих бүх шатанд үр дүнгүй эритропоэз ажиглагддаг.

            Эритрокариоцит эсэд цитоплазмаас гемаглобин үүсэх явц нь цөмийн өөрчлөлтийг нөхцөлдүүлэх бөгөөд цөм нь торлог мөхлөгтэй болдог.  Оксифиль, заримдаа полихроматофиль эритрокариоцитын шатанд цөм арилах ба ингэснээр ясны чөмгөнд ердийн ретикулоцит үүсч цаашдаа эритроцит болон хөгжинө.

            Ясны чөмгөнд хоногт 3 х 10⁹ ретикулоцит эс үүснэ. Үүссэн ретикулоцит ясны чөмгөнд 36-44 цаг боловсроод цусанд орж тэндээ 24-30 цагийн туршид бойжино. Бие гүйцээгүй ретикулоцитууд өөрийн бүтэцдээ (рибосом) ихээхэн хэмжээний РНК агуулах боловч ДНК агуулдаггүй хэдий ч  гемаглобин, липид ба пурин нийлэгшүүлэх чадвартай. Митохондрид нь хүчилтөрөгчийн хэрэглээний явцад АТФ-ийн синтез үүсч  үүнтэй зэрэгцэн анаероб гликолиз явагдана. Ретикулоцитуудын гадаргуу дээр бие гүйцсэн эритроцитийн адил гликофорин А, цусны бүлгийн антиген, резус системийн антиген зэрэг молекулууд байх ба трансферины рецепторын (CD71) тусламжтайгаар төмөрийг шимж чадах бөгөөд хэр зэрэг залуу болохоос хамааран нягтрал нь илүү байдаг.

            Ретикулоцитын диаметр нь 7.7-8.5 мкм байдаг. Ретикулоцитын дундаж эзэлхүүн нь эритроцитоос 24-25% том (101-128 фл) бөгөөд харин гемоглобины агууламж бие гүйцсэн эритроцитоос бага байдаг нь ретикулоцитоз дагалддаг эмгэгүүдийн үед захын цусанд гипохром макроцитууд илэрдгээр тайлбарлагдана. Олон ферментүүд (пируваткиназа, глюкоз-6- фосфатдегидрогеназа, каталаза, ангидраза) бас бусад зарим бодисууд (креатин) ретикулоцитод бие гүйцсэн эритроцитоос хамаагүй илүү хэмжээтэй  агуулагдана. Цаашдын хөгжлийн явцад полирибосом ба экзоцитоз митохондрууд арилах бөгөөд ретикулофиламентоз материалуудын хэмжээ буурна. Эцсийн шатандаа ретикулоцит АТФ  нийлэгшүүлэх чадвараа алдаж харин гемаглобин нийлэгшүүлж эхэлдэг.

            Ретикулоцитын тоо нь ясны чөмгөнд эритроцитын бүтээгдэхүүн үүсэх хурдыг илэрийлдэг учир түүнийг тоолох нь эритропоэзийн идэвхийн түвшинг тодорхойлоход чухал үүрэгтэй. Эритропоэзийн зохицуулгад ЭП гол үүрэгтэй. Эритройд эсүүдийн үүсэлтийг нэмэгдүүлэхийн дээр ретикулоцитын  боловсорч захын цусанд шилжих явцыг ЭП хурдасгадаг.

            Ретикулоцитын үндсэн шинж тэмдэг нь цитоплазмд нь рибосом ба митохондрийн үлдэц болох толбот торолсон бүтэц илрэх бөгөөд үүнийг суправитал будалтаар  илрүүлдэг. Ретикулоцитын өөр үе шатуудад энэ бүтэц адилгүй хэмжээгээр илрэх бөгөөд залуу тусмаа их байдаг.

            Насжилтын зэргээс хамааран Гейльмейрийн ангилснаар ретикулоцитыг 5 бүлэгт хуваадаг (зураг 2).

Зураг 2. Насжилтын зэргээр ретикулоцитуудыг ангилах

Хэвийн үед захын цусанд III ба IV бүлгийн (бүх ретикулоцитын 61% нь IV бүлгийн,   32% нь III бүлгийн, 7% нь  II бүлгийн зөвхөн 0.1% нь  I бүлэгийнх байдаг) ретикулоцитууд илэрнэ. Ретикулоцитын тоо зүүн тийш бие гүйцээгүй эсрүү хэлбийх (0- I- II бүлэг) нь эритропоэзийн хэт идэвхижлийг харуулдаг.

            Ретикулоцитоз нь цус алдалтын анеми, гемолиз, эритропоэтин, витамин В12, фолийн хүчилээр эмчилсэн үед болон бусад зарим эмгэгийн үед гарна. Тамирчдад допингийн хяналт хийхэд гематокрит ба ретикулоцитын үзүүлэлтийг харгалздаг. Эритропоэтин хэрэглэсний шинж нь ретикулоцитоз 2.4%-оос дээш, гематокрит 47% байдаг. Ясны чөмөг амжилттай шилжүүлэн суулгасны хамгийн мэдрэг цэгнүүр нь залуу ретикулоцитын тоо 20% ба түүнээс дээш гарч ихсэх бөгөөд энэ нь  нейтрофиль эсийн тоо ихсэхийн урьдал болдог.

            Ретикулоцитопени нь апластик анеми, заримдаг улаан эсийн аплази, ясны чөмөгний хорт хавдрын үсэрхийлэл, лейкоз, ЭП-ийн түвшин буурах, үр дүнгүй эритропоэз болон миелодиспластик синдромын үед ажиглагдана.

Ретикулоцитын шинжилгээг дараах зорилгоор хийдэг:

·         Гемолиз болон цус алдалтын шалтгаантай эмгэгийн үед эритропоэзийн идэвхийг үнэлэх

·         Төмөр, витамин В-12, В-6, фолийн хүчил ба зэсийн дутлын үед ясны чөмөгний нөхөн төлжилтийн алдагдал болон шаардагдах эмчилгээг хянах

·         Эритропоэтин эмчилгээний үед эритропоэзийн байдлыг үнэлэх

·         Цитотоксик эмчилгээ болон ясны чөмөг шилжүүлэн суулгасны дараа ясны чөмөгний нөхөн төлжилтийн чадамжийг үнэлэх

·         Бөөр шилжүүлэн суулгасны дараа ЭП нийлэгшилтийг үнэлэх

·         Тамирчдад допингийн  (ЭП хэрэглэсэн эсэх) хяналт явуулах

Ретикулоцитын шинжилгээний аргууд:

            Ретикулоцит тоолох олон арга байдаг:  Суправитал будалт  хийж гэрлийн микроскоп ашиглан тоолох, гематологийн анализатороор шинжлэх, урсгал  цитофлюрометрийн аргаар тоолох, эсийн дүрслэлийн анализатороор (АСПЕК, видео-тест) шинжлэх зэрэг болно.

            Саяханыг хүртэл тусгайлан будаж ретикулоцитын харьцангуй  тоог  микроскопын аргаар  тогтоох нь үндсэн шинжилгээ байлаа.  Энэ шинжилгээ нь ажилбар ихтэй, стандартчилал хангалтгүй, шинжилгээний хариуны үнэмшил  сул  болно. Тухайлбал энэ аргын вариацын коэффициент нь өөр өөр судлаачлын тогтоосноор 25%-50% хүртэл гардаг.

            Орчин үед автомат анализатороор шинжлэх болсон бөгөөд шинжилгээний нарийвчлал ихээхэн сайжирч (30000 хүртэл эритроцитын доторхи ретикулоцитийг тоолно), хариуны үнэмшил өндөрсөхийн (вариацын коэффициент 6% орчим) дээр шинэ өндөр ач холбогдолтой үзүүлэлтүүд нэмэгдсэн. Ретикулоцитын бойжилтын зэргийг тодорхойлж, түүнд агуулагдах РНК-ийн хэмжээг гаргах боллоо.

            Хамгийн түгээмэл ретикулоцитын автомат тооллогын хэрэгсэл нь  урсгал цитометри юм. Анализаторуудад хэрэглэдэг урвалж болон тооллогын арга нь өөр өөр болно. Тухайлбал GEN-S (Beckman- Coulter), Cell-Dyn 3500, 3700 (Abbott Diagnoctics) анализаторуудад ретикулоцитын РНК дээр бэхждэг флюрохромгүй будаг болох шинэ метилийн цэнхэрийг хэрэглэнэ.  Sysmex XE-2100, Sysmex XT-2000i, Bayer Advia 120, Cell-Dyn 4000,  ABX Pentra 120 Retic  зэрэг анализаторууд флюресфент цацруулагч будгууд (тиазол оранжевый, тиофлавин Т, полиметин, цианин CD4K530, акридин оранжевый, окзалин 720 г.м ) хэрэглэж байна. Ретикулоцитын тоог нэг язгуурын эсрэгбиетэй зүйсэн флюрохром (Retic-Count, BD) ашиглан урсгал цитофлюрометрээр тоолж болно. Гематологийн анализатороор тоолсон ретикулоцитын тоо нь урсгал цитофлюрометрээр тоолсон дүнтэй сайн тохирч (r=0.977) байна.

            Sysmex XT-2000i анализатороор ретикулоцит тоолох жишээн дээр шинжилгээний зарчмыг тайлбарлая.

Хэмжилтийн зарчим

            Анализатороор ретикулоцитыг шинжлэхдээ флюоресцент цацруулагч “полиметин” будаг ашиглан  урсгал цитофлюориметрийн аргаар эсийг тоолно. Урсгал хундаган дотуур өнгөрөх эсүүд 633 нм долгионы уртын лазерын туяатай огтлолцох агшинд тоологдоно. Лазерийн туяа будагдсан эстэй шүргэлцэхэд эсээс флюоресцент цацраг бага өнцгөөр сарних, их өнцгөөр сарних  болон флюоресцент цацруулагч будгийн импульс нэгэн зэрэг гурван чиглэлд сарнина. Дээрхи мэдээллүүд дохиологдох бөгөөд гэрэл мэдрэн үржүүлэгчид баригдан гурван параметрийн хэлбэрээр бүртгэгдэнэ (зураг 3).

1.    Шууд гэрлийн сарнил (FSC) лазерийн туяа бага өнцгөөр (10⁰ хүртэл) цацрах бөгөөд энэ нь эсийн хэмжээ (тухайн нэгж нь сфер бүтэцтэй бол эзэлхүүнийг гаргана) ба хэлбэрээс хамаарна

2.    Хажуугийн гэрлийн сарнил (SSC)  лазерийн туяа  90⁰ хүртэл их  өнцгөөр цацрах бөгөөд энэ нь эсийн рефрактерийн индексээс (нягт) хамаарах бөгөөд эсийн доторхи  нарийн бүтцийг илэрхийлнэ.

3.      Өвөрмөц флюоресцент дохионы детекц (SFL) хажуугийн сарнилтай параллелаар илрэх бөгөөд эсийн доторхи РНК/ДНК-ийн байдлыг харуулна. 

Зураг 3. Урсгал цитофлюоритетрийн аргын зарчим

Флюоресцент будаг полиметин нь хэвийн эсийн ДНК ба РНК-тай холбогдох бөгөөд үүнийг нь лейкоцитуудын 5 параметр (нейтрофилууд, эозинофилууд, базофилууд, моноцитууд ба лимфоцитууд) болон ретикулоцитыг ялган тоолоход  ашиглана. Ретикулоцитын эгнээний эсийн  хувьд флюоресцент цацруулагч ретикулоцитыг флюоресцент цацруулдаггүй  эритроцитоос ялган таних боломж олгодог (Зураг 4).   

Зураг 4. Цусны эсүүдийн флюоресцент цацруулагч будаг полиметинд илрэх хуваарилга

Эритроцит ба ялтас эсүүд  флюоресцент цацруулдаггүй бол лейкоцитууд хамгийн өндөр флюорецент цацруулна.

Зураг 5.  Ретикулоцит эгнээний эсүүдийн  хэвийн скатерограмм    

Зураг 6. Ретикулоцит эгнээний эсүүдийн  тархалтын схем     

LFR (low fluorescence ratio) бага  флюоресцент цацруулагч  ретикулоцитын бүс

MFR (middle fluorescence ratio)дунд зэрэг  флюоресцент цацруулагч  ретикулоцитын бүс

HFR (high  fluorescence ratio)  өндөр   флюоресцент  цацхуулагч ретикулоцитын бүс

Полимитины цацралтын нягтрал нь эсийн РНК-ийн агууламжийг илэрхийлэх бөгөөд бойжилтын зэргээр нь ретикулоцитуудыг бага, дунд зэргийн ба өндөр флюоресцент цацруулагч ретикулоцит гэж ангилдаг (зураг 6).

            Шинжилгээний дүн нь ретикулоцит эгнээний эсүүдийн скатерограммын  хэлбэрээр илэрхийлэгдэх бөгөөд Х тэнхлэгт тухайн эгнээний флюоресцент импульс (SFL), Y тэнхлэг дээр эсийн размерийг илэрхийлдэг тухайн эгнээний шууд гэрэл сарнилтыг (FSL) харуулна.  Хөх  өнгийн туяарал нь эритроцитын тархалтыг (флюоресцент цацруулахгүй) , ягаан өнгийн туяарал нь флюоресцент хамгийн их цацруулагч бие гүйцсэн ретикулоцитыг  (LFR), харин улаан өнгийн туяарал нь бойжиж гүйцээгүй (MFR+HFR) дунд зэргийн насжилттай (MFR) ба өндөр флюоресцент цацруулагч (HFR) зэрэг  залуу ретикулоцитын  тархалтыг илэрхийлнэ. Хамгийн дор гарсан цайвар цэнхэр бүлэг нь ялтас эсийн тархалтыг харуулна (зураг 5,6).

            Флюоресцент цацралтын гэрлийн өсгөгчийн суваг ба сувгийн дугаарыг илэрхийлэгч  гэрэл сарнилын сувгийн сарнилын өгөгдлүүд нь флюоресцент цацралын нягтралыг илэрхийлэх бөгөөд ингэснээр график дээр эритроцит ба ретикулоцит эсүүдийг ялган зураглана. Анализатор нь эсүүдийн хэмжээгээр нь эрэмбэлэн эритроцит ба ретикулоцитуудыг  ялган тоолохын дээр тэдгээрийн дундаж агууламжийг RBC-Y  ба  RET-Y хэлбэрээр илэрхийлнэ.

            Энэ технологиор шинжлэхэд гематологийн анализатор нь ретикулоцитийн дараахи үзүүлэлтүүдийг тодорхойлдог.

·         Сонгодог үзүүлэлтүүд:

RET% - ретикулоцитын  харьцангуй тоо (% юмуу %%-оор илэрхийлнэ)

RET^#  - ретикулоцитын туйлын тоо ( х10⁹/л)

·         Эзэлхүүний үзүүлэлтүүд:

MCVr (Mean Cell Volume Reticulocytes)  ретикулоцитын дундаж эзлэхүүн (фл)

MSRV (Mean Sphered Reticulocyte Volume) – сферлэг ретикулоцитын дундаж эзлэхүүн (фл)

·         Ретикулоцитийг бойжилтийн зэргийн үзүүлэлтүүд:

LFR%  ( бие гүйцсэн ретикулоцитын 87-99%)

MFR%  (2-12%)

HFR% (1-2%)

IRF (Immature Reticulocyte Fraction- MFR-HFR%) – бие гүйцээгүй ретикулоцитыг фракц (2-14%)

·         Ретикулоцит дахь гемаглобины агууламж:

– RET-Y (FSC-ийн дундаж утгаар илэрхийлэгдэх эсийн размерийн тооцоолсон үзүүлэлт) эсвэл RET-He (хэвийн хэмжээ 28.2- 36.4 пг) эсвэл CHr (Bayer Technicon H2) (хэвийн хэмжээ 28-32 пг)

·         Ретикулоцитын эгнээний  индексүүд: (RPI  ба CRC)

Анемийн үед бөөрний үйл ажиллагаа болон ЭП-ийн  ялгаралт хэвийн  түүнчлэн ЭП-ийн нийлэгшилт болон шүүрэл ихэссэн хүмүүст ретикулоцитоз илэрдэг.  ЭП-ийн шүүрэл ба  нийлэгшилт өндөрсөх нь  ясны чөмөгний үйл ажиллагааг идэвхижүүлэн улмаар бие гүйцээгүй ретикулоцитыг өөрөөсөө чөлөөлж цусанд шилжүүлснээр тэдгээрийн цусанд ороод бойжилтоо үргэлжлүүлэх хугацааг уртасгана.  Энэ үед бие гүйцсэн ретикулоцитын РНК алдан эритроцит болох хугацаа нь дунджаар 24 цаг бөгөөд эритропоэз болон ЭП үүсэлт бөөрөнд нэмэгдсэнээр ясны чөмөгнөөс бие гүйцээгүй ретикулоцит цусны эргэлтэнд ихээр орж тэдгээрийн цусанд бойжих хугацаа нь удаашран 1.5-2.5 хоног болдог.  Цусанд бие гүйцээгүй ретикулоцит ихсэхээр цусны түрхцэнд эритроцитын полихромази гардаг (Зураг 8).       

Зураг 8.  Анемийн үед ретикулоцитын бойжилтын хугацаа өөрчлөгдөх нь

Зөвхөн гематокрит өөрчлөгдсөн бол CRC (Corrected Reticulocyte Count- ретикулоцитын засварласан тоо) индексийг  дараахи томъёогоор тооцоолдог.

CRC= RET% x Ht/0.45

Ht -         өвчтөний гематокрит

RET%- ийм гематокриттэй цусанд тогтоосон ретикулоцитын тоо (%)

0.45 -     зохист гематокрит

Хэрвээ өвчтөнд гематокрит бага байгаагийн дээр бие гүйцээгүй ретикулоцит элбэг бол RPI (Reticulocite production index- ретикулоцитын үүсэлтийн индекс)  тооцоолон гаргадаг.

Анемийн хүндийн зэрэг, ЭП-ийн үүсэх хэмжээ болон бусад олон хүчин зүйлээс шалтгаалан RPI  маш өргөн завсарт хэлбэлздэг (Зураг 9). 

Цусыг хөргөгчид хадгалахад 48 цагийн турш ретикулоцитын үзүүлэлтүүд өөрчлөгдөхгүй. 24-48 цагийн хооронд залуу ретикулоцитын тоо цөөрч, бие гүйцсэн ретикулоцитын тоо өсөх ба 48 цагаас илүү хадгалсан цусанд ретикулоцитын үзүүлэлтүүдийг шинжлэхгүй. Ретикулоцитын тоо насны болон хүйсний хамаарал бараг үгүй. Өндөр уулын бүсэд ялангуяа 1850 м-ээс дээш өндөрт амьдардаг хүмүүст ретикулоцитоз илэрдэг. Жирэмсэн эхчүүдийн цусанд  бие гүйцээгүй ретикулоцит өндөрсөнө. Харин 3 сартай ургийн эритроцитын 90% ретикулоцит байх бөгөөд 6 сар хүрэхэд хэмжээ нь 15-30% болж буурдаг ажээ. Шинэ төрсөн хүүхдийн эритроцитын  2-4% хүртэл   ретикулоцит байх ба 8 дахь хоног дээрээ насанд хүрсэн хүнтэй адил болдог.

Ретикулоцит эгнээний үзүүлэлтүүдийн хэвийн хэмжээг дараахи 2-р хүснэгтээр үзүүлэв 

Хүснэгт 1. Sysmex-XT-2000i анализатороор шинжлэхэд баримтлах хэвийн үзүүлэлтүүд 

Хүснэгт 2. GEN-S,  Becman-Coulter анализатороор шинжлэхэд баримтлах хэвийн  үзүүлэлтүүд