1ШУА-ийн Биологийн хүрээлэнгийн Молекул биологийн лаборатори, 2Монос группын Эм судлалын хүрээлэн
Effects of ellipin to function of hepatic cancer cells
Background
Development and progression of cancer is accompanied by different morphological and functional changes of cells. One of the most important changes is the expression and activity of enzymes in the cellular fatty acids metabolism that reflects in cell membrane lipid composition and increases fluidity of cancer cell membrane. The Ellipin, prepared from bovine liver, is a newly developed anticancer agent containing several important fatty acids.
Goal
To investigate effects of Ellipin on hepatic cancer cell function such as proliferation, migration and adherent activity and apoptosis of cancer cell lines in vitro.
Materials and Methods
This study was conducted in the Laboratory of Molecular Biology, Institute of Biology, MAS. The Ellipin was developed in the Drug Research Institute of Monos group. HepG2, HCC, 23132/87, MDCK cells lines and the primary liver cancer cells (PCC) were used for proliferation assay. Only HepG2 cell line was used for MTT, Migration, Spreading and Apoptosis assays.
Results
The results of proliferation assay showed that the ellipin decreased the proliferation activity of HepG2 and PCC cells depending on concentrations; in 50μg/ml 2-3 times, 250μg/ml fully stopped cells divisions. The Ellipin reduced mitochondrial reeducates enzyme activity of HepG2 cells depending on its concentrations. For example, in 50μg/ml ellipin concentration case, the number of alive cells decreased 2 times.The migration of HepG2 cells treated with 100μg/ml ellipin was decreased by 22.3% compared to the control cells. Also the number of adhered cells was reduced by Ellipin treatment. After 50μg/ml, 100μg/ml, 250μg/ml ellipin treatment, the number of apoptic cells were 14,6%, 45,6%, 100% of initial culture cells, respectively.
Conclusions
Our results showed that the Ellipin suppresses HepG2 cancer cell proliferation and decreases migration and spreading activities and also inducts the cell apoptosis.
Үндэслэл
Сүүлийн жилүүдэд дэлхий дахинд төрөл бүрийн хорт хавдрын өвчлөл болон түүнээс шалтгаант эндэгдлийн тоо тасралтгүй өсөж, улмаар уг өвчний эмчилгээнд шаардагдах хөрөнгө, зардал ихээхэн нэмэгдэх болов. Харин хорт хавдрын эмчилгээнд өргөн хэрэглэгддэг химийн ба туяа эмчилгээ нь гаж нөлөө ихтэй учир байгалийн гаралтай, сөрөг нөлөө багатай эм, бэлдмэл гарган авч ашиглах шаардлагатай байгаа юм. Хорт хавдрын хувиралд орсон эсэд олон тооны бүтэц, үйл ажиллагааны өөрчлөлт үүсч байдгийн нэг нь хавдрын эсийн мембраны тосны хүчлийн хэвийн бүтэц, харьцаа алдагдсаны улмаас мембраны урсамтгай чанар ихсэн бодисын солилцооны тэнцвэр алдагдаж хавдрын эсийн метастазийн идэвхи нэмэгдэх үйл явц гэж үздэг [1, 2]. Хавдрын эсийн мембраны липидийн хос давхрагад нэг хоёрчийн холбоотой тосны хүчлийн агууламж, тухайлбал олейны хүчлийн агууламж хэвийн эсийн мембранынхаас ихэсдэг (18:1) хэдий ч уг эсийн мембранд агуулагдах ханасан тосны хүчлийн дийлэнх хувийг эзэлдэг пальматины хүчил, стерины хүчлийн агууламж буурч хавдрын эсийн мембраны “урсамтгай” чанар нэмэгддэг[2-4]. Мембраны тосны хүчлийн агууламж өөрчлөгдөх нь ханасан тосны хүчлийг ханаагүй тосны хүчил болгон хувиргадаг ферментүүдийн (fatty acid syntase-FAS, stearoyl-CoA desaturase) идэвхи хорт хавдрын эсэд нэмэгддэгтэй холбоотой юм [5-7]. Иймээс орчин үед хорт хавдрын эсийн мембраны тосны хүчлийн солилцоог тэнцвэржүүлэх, дээрх ферментүүдийн идэвхийг дарангуйлах үйлдэлтэй, хавдрын эмчилгээний зориулалттай эм, бэлдмэлийг гарган авахад судлаачид анхаарлаа ихээхэн хандуулж байна [8]. Эллипин нь үхрийн элэгнээс биотехнологийн аргаар гарган авсан, найрлаганд нь тосны чөлөөт хүчлүүд давамгайлсан шинэ бэлдмэл юм. Зарим судалгааны дүнгээс үзэхэд [9,10] эллипин бэлдмэл нь in vitro орчинд J62, Raji, Hela, K582 зэрэг хавдрын шугаман эсүүдийн ургалтыг зогсоох үйлдэлтэй, in vivo орчинд цагаан хулгананд оруулсан U14 умайн хүзүүний хавдрыг багасгах, ургалтыг бууруулах, мөн түүний арьсны S37 саркома хавдрын эсийн ургалтыг дарангуйлах, хавдрын эсийн үхжлийн талбайг нэмэгдүүлэх, судасжилтыг бууруулах зэрэг нөлөөтэй байв. Харин энэхүү судалгааны зорилго нь элэгний хорт хавдрын эсийн үйл ажиллагаа, тухайлбал хуваагдал, шилжин хөдлөх болон гадаргууд наалдах чадвар, апоптозийн үйл явцад эллипин бэлдмэлийн үзүүлэх нөлөөг судлахад оршив.
Материал, арга зүй
Элэгний хавдрын HepG2, ходооодны хавдрын 23132/87, нохойн бөөрний MDCK, нийт 3 төрлийн шугаман эс болон ШУАийн Биологийн хүрээлэнгийн Молекул биологийн лабораторид гарган авсан элэгний хавдрын анхдагч эсийн өсгөвөр (PСC) ашиглаж уг судалгааг хийж гүйцэтгэв. Мөн Эм судлалын хүрээлэнд бэлдсэн эллипиний бэлдмэл ашиглав. Эсийн in vitro өсгөврийг нийтлэг арга зүйн дагуу хийж [11] ашигласан. Эллипин бэлдмэлийг 25/ ml, 50μg/ml, 100 μg/ml, 250 μg/ml, 500 μg/ml тус тус байхаар тооцон эсийн өсгөврийн RPMI-1640 тэжээлийн орчинд уусгаж эсэд үйлчлүүлэн 5% СO2, 37°С-д 24-48 цаг өсгөвөрлөсөн. Эсийн үржэн олшролын судлагааг ургаж буй эсийн тоог гаргах (Proliferation assay)[12] болон эсийн митохондрийн редуктаза ферментийн идэвхийг тодорхойлж тооцох (MTT assay) гэсэн 2 аргаар хийсэн. Эллипиний төрөл бүрийн концентраци бүхий тэжээлийн орчинд ургасан эсээс суспенз бэлдэн дээж авч Неубауер (Neubauer) камерын тусламжтай эсийн тоог тоолж, тооцоог гаргав. Хорт хавдрын эсийн митохондрийн редуктаза энзимийн идэвхийг тодорхойлоход уг энзимийн субстрат WST-8 бодисийг ашиглав. Митохондрын редуктаза энзим нь WST-8 субстратад үйлчилж түүнийг формазин болгон задалдаг. Эсийн шилжэн хөдлөх чадварын судалгааг (Migration assay) [13] дараах байдлаар хийв. Үүнд: HepG2 эсийг өсгөврийн тавганы нүхнүүдэд ижил хэмжээгээр хийж 24-48 цаг 5% СO2 бүхий 37°С-д өсгөвөрлөв. Туршилт эхлэхэд эсийн ургалт 90% орчим хувьтай байх ёстой байхаар тооцов. Хуучин тэжээлт орчныг соруулан авсаны дараа 100 μg/ml концентраци бүхий эллипинтэй RPMI-1640 тэжээлийн орчинг хийж 24 цаг дээр дурдсан нөхцөлд инкубацлав. Улмаар Еппендорф пипеткийн хошуугаар зураас татаж ургаж буй эсийн давхарагад шарх үүсгэсэн. Шархны 2 талын ирмэгний хоорондох зайны хэмжээг тодорхой тогтмол хугацаанд хэмжиж TsView программ ашиглаж харьцуулан үзэв. Гадаргууд наалдах эсийн чадварын судалгаа (Spreading Assay) [14] хийхийн тулд 100 μg/мл концентраци бүхий эллипинтэй RPMI-1640 тэжээлт орчинд болон эллипингүй RPMI-1640 тэжээлийн орчинд HepG2 эсийг 48 цаг өсгөвөрлөсөн. Эсийн өсгөврийн зургыг тодорхой цагийн зайтай, нэг цагт 5 орчим удаа байхаар санамсаргүй талбайгаас сонгон авсан. Туршилтын эцэст эллипинээр үйлчилсэн болон үйлчлээгүй, гадаргууд наалдсан болон наалдаагүй эсүүдийн тоог харьцуулан гаргасан. Апоптозийн судалгааг (Apoptosis assay) [15] хийхийн тулд HepG2 эсийг 50μg/ml, 100μg/ml, 250μg/ml концентраци бүхий эллипинтэй RPMI-1640 тэжээлт орчинд болон эллипингүй DMSO (хэмжээг тухайн нөхцөлд тааруулна) агуулсан RPMI-1640 тэжээлийн орчинд 48 цаг тасалгаат ялтсан дээр тус тусад нь өсгөвөрлөсөн. Эсийг PBS дэхь 10μg/ml концентраци бүхий акридин оранж ба этидиум бромидын (acridine orange/ еthidium bromide) хольц бүхий уусмалаар 30 секунд үйлчлүүлж флоуресценци микроскопийн тусламжтай апоптозид орсон болон ороогүй эсүүдийн тоог тоолон тооцоог гаргасан. Акридин оранж нь бүх эсүүдээр тархаж бөөмийг ногооноор буддаг бол этидиум бромид мембраны бүтцүүд эвдрэлд орсон үед л эсэд шингэж бөөмийг улаанаар буддаг байна. Хэвийн амьд эсүүд ногоон бөөмтэй харагдана. Харин апоптозийн эхний шатанд байгаа эсүүд жижгэрч, хуваагдсан хроматин бүхий шаргал эсвэл улбар шар бөөмтэй харагддаг бол аппоптозийн сүүлийн шатанд орсон эсийн бөөмнүүд улаан өнгөөр будагдана.
Үр дүн, хэлцэмж
Хүний элэгний хавдрын HepG2, ходооодны хавдрын 23132/87, нохойн бөөрний MDCK шугаман эсүүд болон элэгний хавдрын анхдагч эсийн өсгөврийг (PCC) 72 цагийн турш эллипин бүхий тэжээлийн орчинд ургуулан эсийн тоог тооцоолж гаргахад нэгж талбайд ургасан HepG2 болон PCC элэгний хавдрын эсийн тоо эллипин бэлдмэлийн концентрациас хамааран буурч байсан нь ажиглагдав. Тухайлбал, 50μg/ ml эллипин элэгний хорт хавдрын эсийн тоог хяналтын эстэй харьцуулахад 2-3 дахин багасгаж, улмаар 250μg/ml болоход эсийн хуваагдлыг бүрэн дарангуйлж байв. Харин ходоодны хавдрын 23132/87 болон бөөрний хавдрын MDCK эсүүдийн хуваагдалд эллипиний нөлөө элэгний хавдрын эсүүдтэй харьцуулахад нилээд сул, бага байв. Дээрх үр дүн дээр үндэслэн эллипин бэлдмэл нь элэгний хавдрын эсүүдийн олшролт, үржилийг сонгомолоор дарангуйлах үйлчилгээтэй гэж үзэв. Иймд бид цаашдын судалгаануудад элэгний хавдрын шугаман эс болох HepG2-г ашигласан.
2. Pala V, et al. Erythrocyte membrane fatty acids and subsequent breast cancer: a prospective Italian study. J. Natl. Cancer Inst. 2001; 93:1088-95.
3. Koizumi K., Ito Y., Okuda J., Fujii T., Tamiya- Koizumi K., Kojima K. Phospholipase A in the plasma membranes in ascites hepatomas and of normal livers in rat. J. Biochem. 1980; 88:949-54.
4. Pfleger R.C., Anderson N.G., Snyder F. Lipid class and fatty acid composition of rat liver plasma membranes isolated by zonal centrifugation. Biochemistry. 1968; 7:2826-33.
5. Ford J.H. Saturated fatty acid metabolism is key link between cell division, cancer, and senescence in cellular and whole organism aging. Age (Dordr). 2010; 32:231-7.
6. Hulbert A.J. On the importance of fatty acid composition of membranes for aging. J. Theor. Biol. 2005; 234:277-88.
7. Cerne D., Zitnik I.P., Sok M. Increased fatty acid synthase activity in non-small cell lung cancer tissue is a weaker predictor of shorter patient survival than increased lipoprotein lipase activity. Arch. Med. Res. 2010; 41:405-9.
8. Kuhajda F.P. Fatty acid synthase and cancer: new application of an old pathway. Cancer Res. 2006; 66:5977-80.
9. Амбага М., Хаяаши К., Хүрэлбаатар Л., Саранцэцэг Б., Оч Б. Хавдрын эсрэг үйлдэлтэй “Эллипин” эмийн судалгаа. Монголын Анагаах Ухаан. 2001; N1: 9-12.
10. Khurelbaatar L., Ambaga М., Sarantsetseg B., Hayashi K., Zhu L., Li L. Biological activity of new anticancer drug “Ellipin”. International Scientific conference “Current situation and future trends of drug research and development from natural sources. 2010: p.27.
11. Basic Techniques for Mammalian Cell. Current Protocols in Cell Biology. 1998; 1.1.1-1.1.10.
12. Raschperger E., Engstrom U., Pettersson R. F., and Fuxe J. CLMP, a Novel Member of the CTX Family and a New Component of Epithelial Tight
Junctions. The Journal of Biochemistry. 2004; 279:796-804.
13. Chun-Chi Liang., Ann Y. Park and Jun-Lin Guan. In vitro scratch assay: a convenient and
inexpensive method for analysis of cell migration
in vitro. Nature Methods. 2007; 1:30.124
14. Janke J., Schlьter K., Jandrig B., et al. Suppression of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells by the Microfilament Protein Profilin 1. The Journal of Exp. Medicine. 2000; 191.:1675-1686.
15. Ribble D., Goldstein B.N., Norris D. A. and Shellman Y. G. A simple technique for quantifying apoptosis in 96-well plates. BMC Biotechnology 2005;5:1472-6750.
16. Taraboletti G., Perin L., Bottazzi B., Mantovani A., Giavazzi R., Salmona M. Membrane fluidity affects tumor-cell motility, invasion and lungcolonizing potential. Int. J. Cancer. 1989; 44:707-13.
