Эрүүл ахуй, халдвар нян судлалын улсын институт
Өгүүллийн PDF-ийг татах
ВЫДЕЛЕНИЕ Ob'OHX ПОВЕРХНОСТНЫХ АНТИГЕНОВ ВИРУСА ГРИППА МЕТОДОМ ИММУНОХРОМАТОГРАФИИ РЕЗЮМЕ
П. НЯМАДАВА
Гемаглютинин и нейраминидаза рекомбинантного штамма X—31 вируса гриппа; солюблизированного неионным детергентом октил-бета-глюкозидом были выделены в чистом виде с сохранением их биологической активности методом хроматографип на иммуносорбенте нз моноклонального мышиного иммуноглобулина IgO против ней-раминидазы данного штамма.
lgG. был выделен хроматографией на сефарозе, связанном с белком А стафи-лококка (Ст—A—Сефароз) из асцитной жидкости, содержащей моноклональных ан-тител. 1.0 мл гель Ст—А—Сефароза обладает способностью присоединить к себе 4—8 мг lgG, элюция которого происходит в зоне рН 5, С—4,0 при применении нисходящего градиента рН.
Моноспецнфические IgO прнсоединяются к CNBr—Сефарозу в 28%—90% -в за-впсимости от используе1мого клона антисыворотск. 1,0 мл гель СМВг-Сефароза, оптимально нагруженное моноспецифическнм антинейраминидазньш lgG был спосо-бен присоединить к себе приблизительно 400 мкг нейраминидазы от со,люблизиро-ванного вируса, способствуя выделить около 1,6 мг чистого биологически актив-ного гемагглютинина. При применении рН 3,0 к иммуносорбенту присоединенная нейраминидаза элюируется с сохранением своей биологической активности.
Томуутай тэмцэх, найдвартай вакцин хийхэд ихээхэн төвөг учруулж буй шалтгаануудын нэг бол томуугийн вирусийн гадаргуугийн эсрэгтөрөгчийн маш хувьсамтгай чанар юм (1. 2. 10). Тийм ч учраас одоогийн нийтээр мөрдөж буй томуугийн вирусийн ангилал нь вирионыг гадаргуугийн хоёр уураг гемагглютинин, нейраминидазийн эсрэгтөрөгчийн шинж дээр тулгуурлаж байгаа (11. 12. 13) бөгөөд энэ хоёр эсрэгтөрөгчийн хувьслыг молекулын түвшинд судлах асуудал судлаачдын анхаарлын төвд байгаа юм.
Эпидемийн чадавхи, хоруу чанараараа ялгаатай янз бүрийн омгийн гемагглютинин, нейраминидазийн молекулын анхдагч бүтцийг тогтоох, бүтцийн болон эсрэгтөрөгчийн өөрчлөлтийг нь илрүулэхийн тул тэдгээрийн биохими, молекул биологийн шинжилгээнд хүрэлцэх хэмжээгээр цэврээр бэлггэх хэрэгтэй болдог бөгөөд энэ зорилгоор хэт хурилдуураар цэвэрлэж өтгөрүүлсэн вирусийг додецилсульфат натри зэрэг анионт детергентээр задлаж, ацетат целлюлез дзэр электрофорезоор уургийг ялгах юм уу, бромалейн зэрэг уураг задлагч ферментээр гадаргуугийн уургийг липид бүрхүүлд шигдсэн ёзоорын дээгүүр нь огтлон авах аргыг голчлон хэрэглэдэг. Гэвч энэ хоёр арга нь уг хоёр эсрэгтөрөгчийн нэгийг нь эвдээд нөгөөг нь ялгах дээр үндэслэдэг. Нэгдэх арга нь тодорхой төрхтэй рекомбинанг омгийг урьдчилан гарган азахыг шаарддаг, хоёрдахь арга нь уургийн сэргэнгинн гидрофоб үзүүрийг вирионы цөмд үлдээдэг зэрэг дугагдалтай тул аливаа омгийн энэ хоёр уургийг цэврээр нь биологийн идэвхийг нь хадгалан, бүрэн бүтнээр нь ялгаж болох аргыг судлаачид эрэлхийлсээр байгаа юм.
Гемагглютинин, нейраминидазпйн молекулыг идэвхийг нь алдуулахгүйгээр вирионы бүрхүүлээс бүрэн бутнээр нь салгах тухайд бол туйлшраагүй детергенгүүдийг ашиглах нь хамгийн тохиромжтой гэдэгт ихэнхи судлаачнд санал нийлж байна. Вирионоос салсан энэ хоёр уургийг бие биеэс нь ялгахын тулд нягтшилын зөрөөтэй уусмал дээр хэт хурилдуурдах болон хроматографын аргуудыг туршиж буй боловч хангалттай үр дүнд хүрч чадахгүй байгаа юм.
Хатуу бие дээр бэхэлсэн эсрэг бие ашиглан аливаа эсрэгтөрөгчийг бусад хольцоос нь ялгаж, дараа нь ионы хүч, орчны хүчиллэгийг өөрчлөх замаар эсрэгбиетэй холбогдсон эсрэгтөрөгчийг цэврээр нь салган авах дээр үндэслэсэн иммунхроматографын аргыг сүүлийн үед биологийн судалгаанд өргөн ашиглах болж байгаа (6, 19) нь энэ аргыг томуугийн вирусийн гадаргуугийн хоёр эсрэг төрөгчийг цэврээр ялгахад ашиглах санаа төрүүлсэн юм.
Бид энэ судалгаагаараа молекул жин багатай туйлшраагүй детергент октил-бета-глюкозидыг ашиглан вирионоос салгасан гемагглютинин, нейрамнидазийг иммунхроматографын аргаар цэврээр ялгах боломжййг турших зорилт тавьсан юм. Ингэхдээ молекүл бүтцээрээ нэгэн жигд, өвөрмөц чанар сайтай моноклон эсрэг бие хэрэглэн иммунсорбентоо бэлтгэв.
МАТЕРИАЛ БА АРГА
Вирус; Эсрэгтөрөгчийн бүтцээрээ А/Гонгконг (1/68/ГЗН2) омогтой ижил X—31 рекомбинантыг [20] омог болгон авав. Харьцуур омог болгож А/Гонгконг(68/ГЗН2). А/Англи (72/ГЗН2), А/Порт Чалмерс (73/ГЗН2), А/Виктори (75/ГЗН2), А/Англи (75/ГЗН2). А/Техас) 77/ГЗН2 омгуудыг авав. Бүх омгийг 0.1 мл-д 100 XT 50-тунгаар 9-10 хоногтой тахианы үр хөврөлд халдварлуулж, 37°С-т 48 цаг өсгөвөрлөөд аллан тонсын шингэнийг эх материал болгон ашиглав.
Моноклон эсрэгбие: Их Британи, Умарт Ирландын Нэгдсэн Вант Улсын Анагаах ухааны эрдэм шинжилгээний үндэсний хүрээлэн дэх ДЭХБ-ын Томуугийн лавлагаа, судалгааны төвд X-31 омгоор дархлал хийсэн Baeb/C үүлдрийн хулганын дэлүүний эсийг миеломын NS-1 эстэй эрлийзжүулж гарган авсан NS-82; NS-154 эсүүдийг хулганын хэвлийн хөндийд тарьж, үүссэн асцитын шингэнийг моноклон эсрэг бие болгон хэрэглэв.
Вирусийг цэвэрлэж өтгөрүүлэн, гадаргуугчйн эсрэгтөрөгчийг салгах: Вирус өсгөвөрлөсөн аллантопсын шингэнээс вирусийг ялгаж, өтгөрүүлэхдээ полиэтиленгликолиор тундасжуулж, нягтшчлын зөрөө бүхий сахарозын уусмал дээр хэт хурилдуурдах аргыг (21) хэрэглэв. Өтгөрүүлсэн вирусийн 20 мг/мл уураг агуулсан бэлдмэлийг 0.15 М NaCl бүхий рН 8.0 урвалтай трис буферт 10 хувиар бэлтгэсэн н-октил-бета-глюкозидтай (Sigma chemicals со. USA) тодорхой харьцаагаар хольж тасалгааны температурт 30 мин, үйлчлүүлсний дараа Beckman хэт хурилдуурын SW 50.1 роторт 28000 эргэлт/мин-аар 1 цаг хурилдуурдаж вирионы цөмийг тунгаан, гадаргуугийн эсрэгтөрөгчийг ялгав.
Моноклон эсрэг бие агуулсан асцитын шингэнээс иммуноглобулины г ялгах: -даа иммунглобулины Fc—фрагменттай ковалент холбоогоор холбогддог тул сүүлийн үед lgG-r ялгахад өргөн хэрэглэх болж байгаа (22) стафилококкын А уургийг ашиглав. Үунд асцитын шингэннйг Pharmacia Fine chemicals, Sweden пүүсэнд үйлдвэрлэсэн стафилококкын А уурагтай холбоотой CL-48 сефароз (Ст-А-Сефароз) дээр хроматографлаж, холбогдсон lgG-r МкИлвейн буферын рН-ыг 7,0-3,0 болтол шатчилан бууруулах замаар салгав. Уургийн төвшрүүлгийг 280 нм долгионы урттай гэрлийн шингээлтийг Уф-спектрофотометрээр хэмжиж тодорхойлов.
Иммунсорбент бэлтгэх:- дээ Pharmacia Fine chemicals. Sv/ed. пүүсэнд үйлдвэрлэсэн циант бромоор пдэвхжүүлсэн NBr—Се-фарозыг үйлдвэрийн заавар дагуу моноклон lgG-тай холбов.
Иммунхроматограф:-ыг язуулахдаа дээрхи аргаар бэлтгэсэн иммунсорбентыг вирионы цөмөөс нь салгасан гадаргуугийн уургийн бэлдмэлтэй хольж, тодорхой хугацаагаар үйлчлүүлсний дараа хроматографын баганад хийж 2,0 мл-ээр фракцийг цуглуулан фракц бүрт гемагглютичиний болон нейраминидазийн идэвхийг тодорхойлов.
Иммунсорбент дээр холбогдон үлдсэн нейраминидазийг салгахдаа рН 3,0 бүхий МкИлвейн буфер хэрэглэв.
Нейраминидазийн идэвхи ба түүнийг саатуулах таньцийг тодорхойлох:-доо ДЭХБ-ын стандарт арга дээр үндэслэсэн тиобарбитурын урвалын бичил хувилбарыг (7. 8. 9) хэрэглэв. Субстрат болгож Sigma chemicals Co. USA пүүсэнд үйлдвэрлэсэн фетуннийг авав.
Цус наалдуулах идэвхийг тодорхойлохдоо ДЭХБ-ын стандарт арга дээр үндэслэсэн цус наалдуулах урвалын бичил хувилбарыг хэрэглэв. [9]
Уургийн полипептид бүтцийг тодорхойлохдоо 16,5% полиакриламидын гельд элекгрофорезоор (ПААГ ЭФ) ялгаж, кумасси хөхөөр будах аргыг [23] хэрэглэв.
рН-ыг Beckman пүүсний цахилгаан рН-метрээр тодорхойлов.
ҮР ДҮН БА ШҮҮМЖ
1. Моноклон эсрэг бие aгуулсан aсцитын шингэнээс Ст-А-Сефароз ашиглан -г ялгасан нь: 1.0 г хуурай Ст-А-Се-фарозыг рН 8.6-тай трис буферт хонуулж дэвтээхэд 3,5 мл орчим гель үүссэнийг хроматографт хэрэглэв. Моноклон эсрэг бие агуулсан асцитын шингэний уургийг 280 нм долгионы урттай гэрлийн шингээлтээр хэмжихэд 50-80 мг/мл байсан бөгөөд урьдчилсан туршлагаас үзэхэд 3,5 мл гельд хэт ачаалал үүсгэж байсан тул үндсэн туршлаганд асцитын шингэнийг ойролцоогоор 5 мг/мл уураг агуулах болтол рН 8,6-тай трис буферээр шингэлж хэрэглэв. 3,5 мл гель дээр шингэлсэн асцитын шингэнээс 3,0 мл хийж, -0,5 мл/мин. хурдтайгаар гелиэр нэвтрүүлээд үргэлжлүүлэн рН 8.6-тай трис буфер нэмж, фракцийг 2,0 мл-ээр цуглуулан, фракц бүрд рН, уургийн хэмжээ, нейраминидазийн идэвхи саатуулах таньцийг тодорхойлов. Гель нэвтрэн гарсан шингэнд уураг тодорхойлогдохгүй болмогц МкИлвейн буфер рН 7.0-оос эхлэн рН 3,0 хүртэл шатчилан бууруулах замаар хайж фракцийг мөн 2,0 мл-ээс цуглуулан рН, уургийн хэмжээ, нейраминидазийн идэвхи саатуулах таньцийг тодорхойлов. lgG ялгах туршлагын дүнг Зураг 1-д үзүүлэв. Хроматографын эхний 7 фракцид нейраминидазийн идэвхи саатуулах таньцгүй уургууд угаагдан гарсан нь нейраминидазийн эсрэг бие Ст-А-Сефароз-д холбогдон үлдсэнийг гэрчнлж байна.
Цаашид эсрэгбиетэй холбогдсон Ст-А-Сефарозыг рН нь шатчилан буурсан МкИлвечн буферээр утаахад 25 дугаар фракциас эхлээд буюу рН нь 5,0-4,0 байх нөхцөлд нейраминидазийн идэвхи саатуулах таньцтай уураг Ст-А-Сефарозаас салав. Энэ нь бидний ашигласан моноклон эсрэгбие хулганын иммунглобулины lgG 2а хэвшилд хамаарч байгааг илрүүлэв [24]. 25-34 дэх фракцийн уургийн ерөнхий хэмжээ нь ойролцоогоор 4,0 мг болох тооцоо гарч байгаа бөгөөд энэ нь фракциар цуглуулсан бүх уургийн 18% орчим болж байна.
Ялгасан иммунглобулины цэвэршилтийн зэргийг шалгахын тулд полипептидын бүтцийг 16,5% ПААГ Эф-оор тодорхойлоход (Зураг 2) ялгасан уургийн фракцийн нэг нь 50000 орчим дальтон, нөгөө нь 20000 орчим дальтон 2 полипептидийн бүс үүсгзж байгаа нь lgG-ын молекулын дисульфид холбоо нь ангижруулагч нөхцөлд тасарч, полипептидийн хүнд ба хөнгөн хэлхээ болон салсныг үзүулж байгаа' бөгөөд тэдгээрийн молекул жин нь хэвлэлийн материалтай ерөнхийдөө тохирч байна. [25]
Эх материал болох моноклон эсрэг бие агуулсан асцитын шингэний нейраминидазийн идэвхи саатуулах чадал нь маш өндөр байсан бөгөөд X-31 омгийн нейраминидазийг саатуулах идэвхи нь 1 : 3200000 (0,25 мл буюу 3 мл шингэний ерөнхий идэвхи нь 1 : 38400000) болж байв. Хроматографаар ялгасан иммуноглобулины нейраминидазийн идэвхи саатуулах нийлбэр таньц нь 1 : 14000 хэтрэхгүй буюу эх материалын идэвхийн 0,004% орчим байгаа нь хроматографын явцад эсрэгбиеийн эсрэгтөрөгчтэй холбогдох чадвар ихээхэн алдагдаж байгааг харуулав. Харин хроматографын явцад эсрэгбиеийн өвөрмөц чанар өөрчлөгдөхгүй байлаа.
2. Иммунсорбент бэлтгэсэн нь: 1,0 мл CNBr-Сефарозын гелййг 1,0 мг/мл түвшрүүлэгтэй 9,0 м„ч lgG-тай 4°С нөхцөлд 18-20 цаг үйлчлүүлэхэд хэрэглэсэн иммуноглобулины 25-90% нь CNBr-Сефарозтай холбогдож байв. 'lgG-ын CNBr-Сефарозтай холбогдох чадвар нь ашигласан клоноос хамаарч байсан бөгөөд NC-82 клон 25-58%, NC-154 клон 87-90% холбогдож байв.
3. Томуугийн вирусийг окт и л-б е т a - глюко зи д ээр задалсан нь: Бид урьдчилсан туршлаганд октил-бета-глюкозндын эц-сийн түвшрүүлгийг 1%, 2% болон 5%-иар авч үзэхэд гемагглютинин, нейраминидазийн гарцанд орцын зөрөө байхгүй байсан боловч октил-бета-глюкозидын хэмжээ 5% болоход цус наалдуулах идэвхи тодорхой-лохоор хэрэглэсэн тахианы улаан эс гемолиз болж байсан тул үндсэн туршлаганд 2%-ын октил-бета-глюкозид хэрэглэв, Өттөрүүлсэн вирусийг 2% октил-бета-глюкозидаар задлаж, lOOOOOg-д 1 цаг хурилдуурд-саны дараа тундас болон тундсын дээрхи шингэнд нейраминидазийн болон цус наалдуулах идэвхи (Хүснэгт 2), полипептидийн бүрэлдэхүү-нийг (Зураг 2) тодорхойлоход тундсын дээрхи шингэн нь биологий» идэвхээ хадгалсан, уургийн өөр хольцгүй гемагглютинин, нейраминидазийг хангалттай хэмжээгээр агуулж байв.
4. Гадаргуугийн хоёр уургийг иммунхроматогра-фын аргаар ялгасан нь: Урьдчилсан туршлагын үндсэн дээр им-мунсорбент, вирусийн гадаргуугийн уургийн бэлдмэл хоёрыг 37°С-т 1 цаг, тасалгааны температурт 2 цаг үйлчлүүлэх дэглэмийг сонгон авав. Хроматографын эхний фракцууд нь цус наалдуулах идэвхитэй боловч нейраминидазийн идэвхигүй байсан бол рН 3,0-тай МкИлвейн буфер хийсний Дараа иммунсорбентоос салсан уураг нь цус наалдуулах идэвхигүй, нейраминидазийн идэвхитэй байв. (Зураг 3)
Энэ нь бирлогийн идэвхээ хадгалсан гёмагглютинин, нейраминидаз хоёр тус тусдаа ялгарсныг харуулав. Ялгасан уургууд өөр хольцгүй болох нь ПААГЭф-оор мөн батлагдав.
NC—154 моноклон эсрэгбие ашиглан хийсэн иммунсорбентийн 1,0 мл нь ойролцоогоор 400 мкг нейраминидазийг өөртөө нэгдүүлж,1,6 мг гемагглютининыг цэврээр ялгах боломж егч байв. Холбогдсон нейраыи-нидазийг салгасны дараа иммунсорбентыг дахин ашиглахад идэвхээ хадгалж байсан боловч, холбох чадвар нь 20% орчим буурч байлаа.
Ийнхүү энэ аргаар томуугийн вирусийн гадаргуугийн хоёр уургийг нэг омгоос нэгэн зэрэг хангалттай хэмжээгээр, биологийн идэвхийг нь хадгалан цэврээр ялгаж болох нь батлагдав.
ДҮГНЭЛТ
Бага молекул жинтэй туйлшраагүй детергент октил-бета-глюкозид иглан вирионы цөмөөс нь салгасан томуугийн вирусийн гадаргуугийн уургийн холимгоос нейраминидазийн эсрэг моноклон эсрэгбие ашиглан хийсэн иммунсорбент дээр хроматографлах аргаар гемагглютинин, нейраминидазийн аль алийг нь биологийн идэвхийг нь алдагдуулахгүйгээр цэврээр ялгаж болох бөгөөд уургийн гарц нь бусад аргынхаас дутуу-гүй байна.
ТАЛАРХАЛ: Зохиогч энэ судалгааг ДЭХБ-ын шугамаар Их Британи Умарт Ирландын Нэгдсэн Вант Улсын Анагаах ухааны эрдэм шинжилгээний үндэсний хүрээлэн дэх ДЭХБ-ын Томуугийн лавлагаа, судалгааны төвд гүйцэтгэсэн бөгөөд уг ажлыг удирдсан дээрх төвийн захирал, доктор J.J.Skehel, бэлтгэсэн моноклон эсрэгбие өгч тусласан A- Doughlas болон энэ судалгааг хийх бололцоо олгосон бүх хүмүүст талархлаа илэрхийлье.
1. Жданов, В. М. Львов, Д. К. Закстельская, Л. Я. (1978): Ммграция генов вируса гриппа в биосфере, Ж. Микробиол. (Москва), № 7:. 17—21;
2. Жданов, В. М., Львов, Д. К-, Воркутова, Г. К., Букрниская, 1\\К.; Доценко, Г. Н., Владимерцева; Е. А,, Исаченко, В. А., Закстельская, Л. Я. (1980): Олигопептидное картирование как метод классификации вирусов триппа; Вопр. вирусол., №2: 147—151;
3. Кильбурн, Э. Д. (ред.) (1978): Вирусы гриппа н грипп. Перевод с англнй-ского, „Медицица\", М., 585 стр.;
4. Ямникова. С. С, Яхно. М. А., Березина. О. Н., Блоха, В. В., Закс-тельская. Л. Я. (1978): Исследование антигенной специфичности геыагглютинина вирусов гриппа типа А методом радиоимыунологического количественного анал^за: Сравнительное изученне различий в специфичности гемагглютинина НЗ у эпиде-мически активных штаммов, В о п р. в и р у с о л. № 1: 15 — 19;
5. Ровнова. 3. И., Березина. О. Н., Исаева, Е. И., Платонова. А. Л., Бел-кина. Т. С, Трушинская, Г. Н., Григорьева, Т. А., Косяков. П. Н., Жданов, В. М, (1980): Общие антигенные детерминанты в составе гемааглютининов вирусов гриипа HO, Ш и Н 1, В о п р. вирусол., № 5: 541—549;
6. Руослахти. Э. (ред.) (1979): Иымуносорбенты в очистке белков. Перевод санглийского, „Медицина\". М. 128 стр.
Нямдаваа. П. (1978): Миксовирусийн нейраминидазийн идэвхийг тодорхойлох аргачилсан заавар (ЭАХНСУИ-ийн захирлын 1978 оны 90 тоот тушаалаар батлав), 8 хууд;
7. Нямдаваа. П. (1979): Орто ба парамиксовирусийн нейраминидазийн эсрэгтөрөгчийг дүйн тодорхойлох аргачилсан заавар (ЭАХНСУИ-иин захирлын. 1979 оны 85 тоот тушаалаар батлав.). 3 хууд
8. Нямдаваа. П., Алтанхуяг. С. (1978): Вирусийн өвчний ийлдэс судлалын шинжилгээнд цус наалдахыг саатуулах урвалын бичил хувилбарыг хэрэглэх аргачилсан заавар (ЭАХНСУИ-ийн захирлын 1978 оны 49 тоот тушаалаар батлав.) 15 хууд.
10. Stuart—Harris, С. (1979): Epidemiology of influenza in man, Brit. Mep Bull., 35; 3-8;
11. WHO, (1971); A revised system of nomenclature for influenza viruses, Bull. WHO 45: 119—124;
12.; WHO, (1979): Reconsideration of influenza A virus nomenclature: a WHO memorandum, Bull. WHO, 57: 227—233;
13. WHO, (1980): Influenza nomenclature, WHO Wkly Fpidem. Rec, 55: 294-295; 354;
14. Laver, W. O., Air, O. (Eds) (1980): Structure and variation in influenza virus, Developments in cell biology, v. 5, Elsevier, Amsterdam, 395 pp.;
15. Laver. W. O., Bachmayer, H., Weil, R. (Fds.) (1977): The influenza virus haeniagglutinin; Topics in infectious diseases, v, 3, Springer—Verlag, Wien, 215 pp.;
16. Waterfield, M. D., Espile, Flder, K., Skehel, J. J. (1979): Structure of the haemagglutinin of influenza virus, Brit. Med. Bull., 35: 57—63;
17. Webster, R. O., Laver, W. O. (1980): Determination of the number of nono-verlapping antigenic areas on Hongkong (H3N2) influenza virus hemagglutinin with monoclonal antibodies and the telection of variants vith potential epidemiological sig-nificanse, Virology, 104: 139—148;
18. Helenius, A., Simons, K. (1975): Solubilization of membranes by detergents, Biochi.m. Biophys. A c t a, 415: 29—79:
19. Lowe, C. R. (1979); An introduction to affinity chromatography, In: Laboratory
chniques in bioshemistry and molecular biology, v. 7, pp. 269—522;
20. Kilbourne, E. D„ Schulman, J. L., Schild, O. C, Schloer, Q., Swanson, J., Bucher, D. (1971): Correlated studies of a recombinant influenza virus vaccine, 1. Derivation and charecterlzatlon of virus and vaccine, J. Infest. Dis.. 124; 449—462;
21. Heyward, J. T., Klimas, R. A., Stapp, M. D., Obijeski, J. F. (1977): The ra¬pid concentration and purification of influenza virus (from allantoic fluid, Arch. V i rol., 55; 107—119;
22. Goding, J. W. (1978): Use of staphylocopcal protein A as an immunological reagent, J. Immunol. Methods, 20: 241—253;
23. Skehel, J. J., Schild, O. C. (1971): The polypeptide composition of influenza virus, Virology, 44; 396 . 408;
24. Ey, Prowse, S. .R, Jenkin, C. S. (1978): Isolation of pure IgQ7, lgQ2a , and lg02b , immunoglobulins from mouse serum using protein-A-sepharose, I m m u n o c h e-mistry,15, 429—436;
25. Litman, Q. W., Good, R. A. (Fds.) (1978): Imm
