Монголын анагаах ухаан, 2014, 2(168)

GSTT1, GSTM1 генийн делецийг Taq 2x Dual master mix ашиглан илрүүлэх шинжилгээний арга

( Судалгааны өгүүлэл )

Г.Уянга¹, Ж.Зандраа², С.Ганболд³, С.Өнөрсайхан¹, Д.Сувд¹

¹Нийгмийн эрүүл мэндийн үндэсний төв, ²Чорос-Онош лаборатори, ³Шүүхийн шинжилгээний үндэсний хүрээлэн

 

   Өгүүллийн PDF-ийг татах

Абстракт

1. PCR with Taq 2x Dual master mix (Mongolia) resulted in all four initially desiredPCR products as 625bp for GSTM1, 969bp for GSTT1 genes and 4748bp for  GSTM1, 3106bp for GSTT1 gene deletions correspondingly;
2. Template genome DNA prepared from fresh peripheral blood lymphocytes by guanidine hydrochloride extraction methods suited best for “long” PCR reaction;
3. Using Taq 2x Dual master mix produced in Mongolia saved us time and was cheaper.
4. Multplex primer mix is excellent tool in research of GST gene polymorphism.

Үндэслэл

Хүний бие махбод хортой бодисыг хоргүйжүүлэх тогтолцоотой байдаг. Тэдний нэг болох глутатион- S-трансфераза бүлгийн ферментүүд маш олон төрлийн химийн бодисыг хоргүйжүүлэхэд оролцдог бөгөөд дотроо хэд хэдэн бүлэгт хуваагддаг. Хүний популяцид GSTT1, GSTM1, GSTP1 бүлгийн ферментийн мэдээллийг нөхцөлдүүлдэг генийн олон хэлбэршил түгээмэл тохиолддог байна [1-6]. Мутацид орсон GSTT1, GSTM1 генийн хувилбарыг гомозигот хэлбэрээр агуулсан хэв шинжид эдгээр ферментийн идэвхи бүрэн алдагдсан байдаг, иймээс эдгээр хувилбаруудыг орчны болон ажил мэргэжлээс  шалтгаалсан бохирдлоос хамаарсан эмгэгийн эрсдлийг илрүүлэхэд генетик маркер болгон ашиглахад нэн тохиромжтой, учир нь судлагдахуун популяцийг эмгэг үүсгэгч - эмгэг шинжийн хамаарлыг тогтоох боломжтой маш тодорхой хоёр бүлэгт  ангилж ажиглах боломжийг олгодог [7-9]. Мөн түүнчлэн давсаг,  төмсөг, түрүү булчирхай, уушги, гүйлсэн булчирхай, хөхний өмөнтэй холбож судалсан судалгаа шинжилгээний ажил ихээхэн хийгдсэн байна [10-17]. Уг боломжинд үндэслэн GSTT1, GSTM1 генийн олон хэлбэршлийг маш олон судалгаанд өргөнөөр ашигласан байдаг.

Олон улсад GST генийн олон хэлбэршлийг хэд хэдэн аргаар, тухайлбал Multiplex полимеразын гинжин урвал(ПГУ)-ын аргаар судлан тогтоодог байна [1, 4]. Монголд GST генийн олон хэлбэршлийг уул уурхай, умайн хүзүүний өмөнтэй холбон судалсан судалгаа байдаг ба тэдгээр судалгаагаар зөвхөн гээгдэх мутацид орсон GSTT1, GSTM1 генийн хувилбарыг гомозигот хэлбэрээр агуулсан хэв шинжийн давтамжийг тогтоох дээр үндэслэсэн байна [18]. Бид судалгаандаа GSTT1, GSTM1 генийн хэвийн болон гээгдэх мутацид орсон хувилбаруудыг агуулсан гетерозигот хэвшлийн давтамжийг тогтоох,өөрөөр хэлбэл ПГУ-аар “Long” буюу “Урт” бүтээгдэхүүн гарган авах шинжилгээний арга боловсруулах зорилго тавьсан.

Зорилго:

ПГУ явуулж GSTT1, GSTM1 генийн “Long” буюу “Урт” бүтээгдэхүүн гарган авах арга боловсруулах

Зорилт:

1. Геномын ДНХ ялгах
2. GSTT1, GSTM1 генийн хэвийн болон мутацид орсон хувилбарыг ПГУ-ыг ашиглан гарган авах

Материал, арга зүй

Судалгааны түүвэр: Судалгаанд олон жил бичил уул уурхайн олборлолт хийгдэж байсан Төв аймгийн Жаргалант, Борнуур сум, мөн уул уурхайн үйл ажиллагаа хийгдээгүй зэргэлдээх Баянчандмань сумын оршин суугчдаас сайн дурын үндсэн дээр, таниулсан зөвшөөрлийн дагуу 2013, 2014 онуудад цуглуулсан 117 биологийн сорьцыг ашиглав. 

Геномын ДНХ ялгалт: Судалгаанд цус, завьжны арчдасны сорьц цуглуулсан ба захын судасны цуснаас гуанидин-гидрохлоридын арга, завьжны арчдасны сорьцоос фенол-хлороформын аргаар геномын ДНХ ялгав.

ДНХ-ийн агууламжийг тооцох: ДНХ-ийн агууламжийг стандарт К562 DNA High Molecular Weight, 2800 M Control DNA (10ng/ μl)-тай харьцуулан 0,8 %-ийн агарозын гельд электрофорез явуулж үнэлэв.

ПГУ:Судалгаанд Bioneer фирмийн “Mygene32 thermal block” төхөөрөмж ашигласан. Multiplex ПГУ-ын аргаар GSTT1, GSTM1 генийг өвөрмөцөөр таних праймернайруулах: Праймерийг хоёр хувилбараар бэлдэв. Үүнд: Үйлдвэрлэгчээс савласан 100 пикомоль/мкл эх уусмалаас 1-р хүснэгтэнд харуулсан праймер бүрт харгалзах агууламжтай  праймерын холимог бэлдэв. Праймер тус бүрийг 10 дахин шингэлж (праймер тус бүрээс 5 мкл дээр нь 45 мкл ус холив) ажлын уусмал бэлтгэв.

Table 1. Multiplex PCR primers

Мастер холимог гарган авах, ПГУ явуулах нөхцөл: Мастер холимог бэлтгэхдээ Taq 2x Dual мастер холимог ашигласан (2х ПГУ-ын буфер pH=8.5, dNTPтус бүр 500 мкмоль, 2.5 мкмоль MgCl2, Taq ДНХ полимераза) ба урвалын нийт эзэлхүүн 25 мкл байхаар бэлтгэв. ПГУ-ын эхний денутрацийг 940С-3 минут дараагийн денутрацийг 940С-30 секунд, хослуулах 680С- 7 минут, уртасгах 680С-7 минут, 720С-10 минут явуулах программыг оруулж, 35 цикл явагдаж дуусмагц сорьцыг ПГУ-ын машинаас гарган авч гель электрофорез гүйлгэв.

Агароз гель электрофорез: ПГУ-ын бүтээгдэхүүнийг үнэлэхдээ 0.8%, 1.5%-ийн агарозын гельд 1хTBE буферийн орчинд гүйлгэж Bioneer фирмийн 100 х.н. урттай молекул жингийн стандарт хэмжээ тогтоогчтой харьцуулан үнэлэв. Электрофорезыг 100 B-ын хүчдэлд залган 25 минутын турш гүйлгэж гелийн зургийг “BioSens Imaging systems” төхөөрөмжөөр авав.

Үр дүн

Геномын ДНХ-г ялгасан үр дүн: ДНХийн агууламжийг стандарт К562 DNA High Molecular Weight, 2800M Control DNA (10ng/ μl)–тай харьцуулан, 0.8%-ын агарозын гельд электрофорез явуулж үнэлэв (Зураг1).

Figure 1. Result of extraction genomic DNA with Guanidine-Hydrochloride 

МultiPlex ПГУ-аар GSTT1, GSTM1 генийг илрүүлсэн дүн: 2013 онд цуглуулсан 79 сорьцонд GSTT1, GSTM1 генийн олон хэлбэршлийг тогтоох шинжилгээг хийхэд 8 сорьцод GSTM1 гений хэвийн хувилбар буюу ПГУ-ын богино бүтээгдэхүүн (625 х.н), 18 сорьцонд GSTT1 генийн хэвийн хувилбар буюу ПГУ-ын богино бүтээгдэхүүн (969 х.н)  тус тус илрэв, 14 сорьцод GSTT1/GSTM1 ген хоёулаа, харин 11 сорьцод ямар нэгэн ДНХ-ийн хэрчим илрээгүй болно (Зураг 2, 3).

Figure 2. Results for PCR with Taq 2x Dual  master mix (Mongolia), where genome DNA is extracted by phenol chloroform methodused as template

Зураг 3-аар multiplex ПГУ явуулсан үр дүнг 1,5%-ын агароз гель электрофорез гүйлгэн үнэлсэн байдлыг жишээгээр харуулав. Гелийн зургаас харахад нийт 17 сорьц гүйлгэж үнэлсэн ба эдгээрийн 1, 4, 8, 11, 15-р сорьцод 625 х.н.бүхий ДНХ-ийн хэрчим буюу GSTM1 гений хэвийн хувилбар олширсон болох нь харагдаж байна. Харин 2, 5, 9-р сорьцонд 969 х.н бүхий ДНХ-ийн хэрчим буюу GSTТ1 гений хэвийн хувилбар, сорьц 3, 5, 6, 10, 12, 13, 14, 16, 17- р сорьцонд ДНХ-ийн хэрчим үүсээгүй болох нь харагдаж байна. Энэ хүртэлх судалгаанд ашигласан арга, ПГУ явуулах нөхцлөөр ПГУ-ын “Урт” бүтээгдэхүүн илрээгүй тул гээгдэх мутаци илрүүлэх нөхцлийг тогтоох шаардлага үүсэв.

Figure 3. Result of determination of GSTT1 and GSTM1 gene usingМultiPlex PCR

МultiPlex ПГУ-аар GSTT1, GSTM1 генийн гээгдэх мутаци орсон хувилбар буюу делеци илрүүлсэн дүн: Дээр өгүүлсэнээр ПГУ-ын “Урт” бүтээгдэхүүн буюу GSTM1 - ийн хувьд (4738 х.н), GSTТ1-ийн хувьд (3106 х.н.) урттай ДНХ-ийн хэрчмүүд нь тус тус эдгээр генүүдийн делецийн маркерууд юм. Туршилтаар фенол хлороформын аргаар ялгасан ДНХ-ийг ПГУ-д ачааллаж “Урт” бүтээгдэхүүнийг гарган авах туршилтыг 26 сорьцондөөр өөр хувилбараар явуулав. Зураг 4-т Мultiplex ПГУ-аар GSTT1, GSTM1 генүүдийн делецийг илрүүлсэн дүнг харуулав. Гелийн зургаас харахад нийт 6сорьцны1, 2, 4, 5-р сорьцод 4738 х.н.бүхий ДНХ-ийн хэрчим буюу GSTM1 генийн делеци олширсон болох нь харагдаж байна. Харин 1, 2, 3, 4, 5, 6-р сорьцонд 3106 х.нбүхий ДНХ-ийн хэрчим буюу GSTT1 генийн делеци, 2, 3, 4, 5, 6-р сорьцонд 969 х.н. урттай ДНХ-ийн хэрчим буюу GSTТ1 ген, 2, 6-р сорьцод 625 х.н.бүхий GSTM1 ген олширсон болох нь харагдаж байна. 

Хэлцэмж

Судалгааны үр дүнг 2, 3-р хүсэгтэнд нэгтгэж харуулав. Геномын ДНХ ялгахад шинэ шингэн цус бусад төрлийн сорьноос илүү үр дүн өгч байв (Хүснэгт 2).

Figure 4. Result of determined GSTT1 and GSTM1 deletion by МultiPlex PCR

Table 2. Lon g PCR template DNA preparation methods

3-р хүснэгтээс харахад шингэн цуснаас гуанидин-гидрохлоридын аргаар ялгасан геномын ДНХ-ийг ПГУ явуулахад ашигласан тохиолдолд аль ч компаний үйлдвэрлэсэн урвалын мастер холимогийг ашигласан ч “Урт” бүтээгдэхүүн илэрэх хандлагатай байв. Харин урвалын мастер холимогийг компаниудаар нь харьцуулбал Монголын “Чорос-Онош” лабораторид үйлдвэрлэсэн мастер холимог хамгийн сайн үр дүн өгч байв.

Table 3. Long PCR efficiency

Дүгнэлт:

1. Бид ПГУ–ын “Урт” бүтээгдэхүүн гарганавахын тулд ПГУ-ын 3 өөр төрлийн нөхцлөөр туршилтыг хийж 625, 969, 3106, 4748 х.н.урттай ДНХ-ын хэрчмийг гарган авав.
2. ПГУ - ын “Урт” бүтээгдэхүүн гарган авахын тулд геномын ДНХ ялгах арга их ач холбогдолтой бидний судалгаагаар фенолхлороформын аргаар ялгах нь тохиромжгүй харин гуанидин-гидхорлоридын аргаар ялгах нь илүү үр дүнтэй байна.
3. Цаашид дээрхи аргаар Монголд гарган авсан Taq полимераза ферментийг судалгаа шинжилгээнд ашиглах нь цаг хугацаа болон, хөрөнгө мөнгө хэмнэх боломжтой гэж үзэж байна.
4. Геномын түвшинд Multiplex праймерын холимог ашиглан GST генийн судалгаа хийх бүрэн боломжтой байна.

Ном зүй

1. Anders Buchard, Juan J. Sanchez, Kim Dalhoff and NielsMorling. Multiplex PCR Detection of GSTM1, GSTT1, and GSTP1 Gene VariantsJournal of Molecular Diagnostics, Vol. 9, No. 5, November 2007
2. David L.Eaton and Theo K. Bammler. Concise Review of the Glutathion S-Transferases and their Significance to Toxicology. Toxicology Science 49, 156±165, 1999
3. Andersson, C. , Mosialou , E . , Weinander , R . , and Morgenstern , R . ( 1994 ) . Enzymology of micro somalglutathione Stransferase. Adv.Pharmacol.27, 19±35.
4. A r m s t r o n g , R . N . ( 1 9 9 7 ) . S t r u c t u r e , c a talyticmechanismandevolutionofthe glutathionetransferases.Chem.Res. Toxicol.10,2±18.
5. Wormhoudt LW, Commandeur JN, Vermeulen NP, Genetic polymorphisms of human N-acetyltransferase, cytochrome P450, glutathione-S-transferase, and epoxide hydrolase enzymes: relevance to xenobiotic metabolism and toxicity. Crit Rev Toxicol.1999; 29:59-124.
6. Morahan, J.M., Yu, B., Trent, R.J., Pamphlett, R., 2007. Genetic susceptibility to environmental toxicants in ALS. Am. J. Med. Genet. B. 114B, 885-890.
7. Miller MS, McCarver DG, Bell DA, Eaton DL, Goldstein JA. Genetic polymorphisms in human drug metabolic enzymes. FundamApplToxicol1997; 40:1-14.
8. Jana Soearmanova, Lucie Tynkova, SimonaSoesova, Ivan Gut and PavelSoucek. Genetic polymorphisms of biotransformation enzymesallele frequencies in the population of the Czech Republic. Pharmacogenetics 2000, 10:781±788
9. Jaclyn M. Goodrich and NiladriBasu 2012. Variants of glutathione s-transferase pi 1 exhibit differential enzymatic activity and inhibition by heavy metals. ToxicolIn Vitro. 2012 June; 26(4): 630–635. doi:10.1016/j.tiv.2012.02.005.
10. Bell, D.A., Thompson, C.L., Taylor, J., Miller C.R., Perera, F., Hsieh, L.L, et al., 1992. Genetic monitoring of human polymorphic cancer susceptibility genes by polymerase chain reaction: Application to glutathione transferase. Environ. Health Perspect. 98, 113- 117.
11. Harries L.W., Stubbins,M.J., Forman D., Howard,G.C., and Wolf, C.R. (1997). dentification of genetic polymorphisms at the glutathione- Stransferase Pilocus and association with susceptibility to bladder, testicular and prostate cancer.Carcinogenesis18,641-644.
12. Rebbeck TR. Molecular epidemiology of the human glutathione S-transferase genotypes GSTM1 and GSTT1 in cancer susceptibility. Cancer Epidemiol Biomarkers Prev1997; 6:733-743.
13. Strange RC, Fryer AA. The glutathione Stransferases: influence of polymorphism on cancer susceptibility. In: Ryder W, ed. Metabolic Polymorphisms and Susceptibility to Cancer. Lyon, France: International Agency for Research in Cancer;1999(148):231–249.
14. Moyer, A.M., Salavaggione, O.E., Hebbring, S.J., Moon, I., Hildebrandt, M.A.T., Eckloff, B.W., et al., 2007. Glutathione s-transferase T1 and M1: Gene sequence variation and functional genomics. Clinic Cancer Res. 13, 7207-7216.
15. Cote ML, Kardia SL, Wenzlaff AS, Land SJ, Schwartz AG: Combinations of glutathione S-transferase genotypes and risk of earlyonset lung cancer in Caucasians and African Americans: a populationbased study. Carcinogenesis 2005, 26:811–819
16. Ye Z, Song H, Higgins JP, Pharoah P, Danesh J: Five glutathione S-transferase gene variants in 23,452 cases of lung cancer and 30,397 controls: meta-analysis of 130 studies. PLoS Med 2006, 3:e91
17. Zhang H, Ahmadi A, Arbman G, Zdolsek J, Carstensen J, Nordenskjold B, Soderkvist P, Sun XF. Glutathione S-transferase T1 and M1 genotypes in normal mucosa, transitional mucosa and colorectal adenocarcinoma. Int. J. Cancer 1999, 84:135–138
18. Б.Ичинхорлоо, Д.Орхонсэлэнгэ. GSTT1, GSTM1 генүүдийн тархалт ба делецийн судалгаа. Эрүүл ахуйч, тархавар судлаачдын үндэсний зөвлөлийн хоёрдугаар зөвлөгөөн. Эрдэм шинжилгээний бага хурлын эмхэтгэл. УБ, 2013 он. х.233

 

Танилцаж нийтлэх санал өгсөн : Академич Л.Лхагва

Нийтлэлийн нээгдсэн тоо: 601