Хөх хот, Өвөр Монголын Их Сургуулийн Биологийн сургууль 010021.
Өгүүллийн PDF-ийг татах
Lysophosphatidic acid（LPA）is a bioactive phospholipids mediator, which elicits a variety of biological functions mainly, through G-protein coupled receptors. Although LPA is shown
to stimulate proliferation and motility via LPA receptors, LPAR1, and LPAR3 in several cancer cell lines, but the role of LPA receptors in gastric cancer cells still being unknown. However, several researches reported that LPAR2 play an important role in the carcinogenesis of gastric cancer，but no report to shows the LPAR3 Involvement in the carcinogenesis . In this study, we aimed to determine the role of specific LPA receptor subtypes in BGC803 cell migration and it’s on receptor-mediated signaling pathway.
Үндэслэл: Лизофосфатидын хүчил (LPA) нь хорт хавдрын эсийн тархалт, шилжилт хөдөлгөөн болон эсийн хэт олшролыг бий болгох физиологийн өргөн хүрээний үйлчлэл бүхий био идэвхтэй фосфолипид юм . Сүүлийн жилүүдэд лизофосфатидын хүчлийг эсийн дотор химессежер молекул гэж үзээд, эсийн хэт олшрол, тромбоцитын аггрегацыг дэмжих болон хавдрын эсийн нэвч илтэд гөлгөр булчингийн эсүүдийг оролцуулдаг биологийн үйлчлэлтэй болохыг олж тогтоосон [1,12,13]. Лизофосф атидын хүчил нь G уурагтай холбоотой рецепторуу даар (GPCRs) биологийн олон янзын үйлчлэл үзүүлдэг [2,6]. Түүнчлэн эсийн гаднах сигналын молекулаар дамжуулан G уурагтай холбоотой 8 рецепторт үйлчилж идэвхижүүлдэг байна [7,9]. Лизофосфатидын хүчлийн физиологи болон патофизиологийн үйлчлэл их өргөн хүрээтэй [5]. Энэ нь рецепторуудын (LPARs) экспрессын хэлбэр болон түүнтэй холбоотой сигналын замуудын идэвхижилтэй холбоотой байдаг. Лизофосфатидын хүчил нь рецепторуудын (GPCRs) тусламжтайгаар Са2+ моб илизаци, актины бүтцийн цАМФ хуримтлалыг өөрчилж, ингэснээр эсийн хэлбэр, хөдөлгөөн хувирч эсийн хэт олшролын олон янзын хэлбэрүүдийг үүсгэдэг байна [11]. Лизофосфатидын хүчил болон тэдгээрийн G уурагтай холбоотой рецепторуудыг (GPCRs) ходоодны хавдрын процесст оролцдог болохыг тогтоосон . Эдгээр лизофосфатидын хүчлүүд, тэдгээрийн рецепторуудыг ходоодны хавдрын процессын үед эпидермын өсөлтийн факторын рецепторыг (EGFR) идэвхижүүлдэг болохыг тогтоосон [10]. Ходоодны хавдрын процессын судалгаанд LPAR 1-3 рецепторуудыг идэвхитэйгээр судалж байна [3,14]. Энэхүү судалгааны ажлаараа бид BGC803 эсийн миграцид нөлөөлж байгаа LPA рецепторыг тогтоох, уг рецепторт хамааралтай сигналын замуу дыг судлах зорилт тавьсан юм . Бид лизофосфатидын хүчлийг BGC803 эсийн миграцид гол нөлөө үзүүлэгч бодис гэж үзсэн. Арга зүй: Эсийн миграцын туршилт. Энэ турш илтад 8μm хэмжээтэй нүх бүхий поликарбонат мембр антай Transwell аягыг (Corning,USA )хэрэглэнэ. Transwell аяганы дээд талд 1% желатины уусмал дусааж 20 мин болгосны дараа тавагны доод хэсэгт 0.1% BSA агуулсан DMEM тэжээлийн орчин хийнэ. Тавагны дээд хэсэгт 0.1% BSA агуулсан DMEM тэжээлийн орчинд суспенз болгосон эсүүдийг (2x105/ml) хийж өгнө. 37°C болон 5% CO2 нөхцөлд инкубаторт 12 цагаар миграц явуулна. Сэдээгч бодисын нөлөөгөөр эсүүд мембраныг нэвтлэн гарна. Нүүдэлд өртөөгүй үлдсэн эсүүдийг спирт шингээсэн хөвөнгөөр зөөлөн арч иж авна. Нүүсэн эсүүдийг 0.2% гем атокс илины уусм алаар бу даад, гэрлийн микроскопын x 200 то хируу лгаар тоо лно. Энэ турш илтыг дээрх нөхцөлөөр 3-аас дээш удаа давтан гүйцэтгэнэ. q RT-PCR. (total) РНХ ялгах kit-ийн (Bio Basic Inc., Markham, ON, Canada) зааварч илгааны дагуу (total) РНХ- г ялгана. РНХ-ийн препарац дахь геномын ДНХ-ийн үлдэгдэлийг зайлуулахын тулд DNase I (MBI Fermentas, Amherst, NY, USA)-аар үйлчлүүлнэ. AMV First Strand cDNA Synthesis kit (Bio Basic Inc.)- ээр Reverse-transcription-д 5μg (total) РНХ-г хэрэглэнэ. Урвалд дараах праймеруу дыг ашигласан. Үүнд: LPAR1 forward, 5′-TCCTGTCCCGCGCCAGGTACAC-3′; LPAR1 reverse, 5′-GGTGGTGAACACGCCCCAGAACT-3′; LPAR2 forward, 5 ′ - A C C G C A G T G T G AT G G C C G T G - 3 ′ ; LPAR2 reverse, 5′-TAGGAGCGGCTGAGCAGGGG-3′; LPAR3 forward, 5′-GCCGTGGAGAGGCACATGTC-3′; LPAR3 reverse, 5′-TGGCGATGGCCCAGACAAGC-3′; GAPDH forward, 5′-TCAAGTGGGGCGATGCTGGC-3′; GAPDH reverse, 5′-TGGGGGCA TCAGCAGAGGGG-3′. q RT-PCR-ийг Hot Start Fluorescent PCR Core Reagent kit (Bio Basic Inc.)-ийн зааврын дагуу гүйцэтгэнэ. Циклын нөхцөл нь 94°C-д 4 min, 35 цикл нь 94°C- д 30 sec ,60°C- д 30 sec байхаар тохируу лна. Дээжүүдийн ген ийн м РНХ-ийн түвшинг GAPDH-ийн мРНХ -ийн түвшинтэй харьцуулна. 2[Ct(GAPDH) - Ct(target gene)] үнэлгээгээр тооцож тогтооно . Quantitative RT-PCR Chromo4 detector (BioRad, Hercules, CA, USA) –ээр ажлыг хийж гүйцэтгэсэн.
Үр дүн: Лизофосфатидын хүчил (LPA) ходоодны хавдрын BGC803 эсийн миграцыг өдөөдөг болох нь 1% желатины уусмал шингээсэн поликарбонат мембрантай Transwell-ээр эсийн миграцыг явуулсан. Лизофосфатидын хүчил (LPA)-ийн эсийн миграцыг өдөөж байгаа сигналын замыг тогтоохын тулд LPAR1 болон LPAR3 рецепторуудын антигонист болох Ki16425-г хэрэглэсэн. Бид LPA-өдөөгдсөн эсийн миграцыг Ki16425 бууруулж байгааг олж тогтоосон юм (график1).
.jpg)
График 1. LPA-өдөөгдсөн эсийн миграцид LPAR1/LPAR3-ийн ингибитор Ki16425-ийн нөлөөлөл. Энэ туршилтад Ki16425 болон pertussis toxin (PTX) хэрэглэсэн. Тавагны доод хэсэгт 1μM LPA, 100ng/mL PTX and 0.1mM Ki16425-ийг 0.1% BSA агуулсан DMEM-нд уусган хэрэглэсэн. Тавагны дээд хэсэгт дээр дурдсан хэмжээгээр эсийн суспенз хийж миграц явуулна. Зургаан давталттай туршилтын дундаж утга (±SE), (*P<0.05, **P<0.01). Нүүсэн эсүүдийг 0.2% гем атокс илины уусм алаар будаад, зураг авсан (зураг1).
.jpg)
Зураг 1. LPA-өдөөгдсөн эсийн миграцыг Ki16425 саатуу лж байна. (A) 1μM лизофосфатидын хүчил (LPA)-ээр миграц өдөөгдөж байна. (B) 0.1mM Ki16425 эсийн миграцыг саатуулж байна. LPA-өдөөгдсөн BGC803 эсийн миграцид Gi холбоот рецептор оролцдог болох нь LPA-өдөөгдсөн BGC803 эсийн миграцид G уург ийн аль хэлбэр оролцож буйг тогтоох зорилгоор Gq уургийн ингибитор болох YM-254890, Gi уургийн ингибитор pertussis toxin (PTX)-г хэрэглэсэн. LPA-өдөөгдсөн BGC803 эсийн миграцыг YM-254890-аас илүү pertussis toxin (PTX) бууруу лж байгааг илрүүлсэн (график 2).
.jpg)
График 2. LPA-өдөөгдсөн BGC803 эсийн миграцид Gq болон Gi уург ийн оролцоо . Лизофосфатидын хүчил (LPA)-ийн үйлчлэлийг 50ng/ml PTX болон 1μM YM- 254890 ингибиторуудаар дарангуйлсан. Зургаан дав алттай туршилтын дундаж утга (±SE), (**P<0.01). BGC803 эсийн LPAR1, LPAR2 болон LPAR3 рецепторуудын RT-PCR-ын анализ. Энэ туршилтын дүнгээс харахад BGC803 эсэд LPAR3 рецептор ихээр экспресслэгдэж байна. Энэ нь LPA-өдөөгдсөн BGC803 эсийн миграцид LPAR3 рецептор хамааралтай болох нь харагдаж байна (график 3).
.jpg)
График 3. BGC803 эсийн миграцид оролцож байгаа LPAR 1-3 рецепторуудын экспресс . (total) РНХ ялгах зааврын дагуу РНХ-г ялгана. LPAR1-3 рецепторуудын мРНХ-г эргэх транскрицид оруулж, real-time PCR явуулна. Экспрессын үр дүнг GAPDH-н мРНХ-тэй харьцуулна. Гурван давталттай туршилтын дундаж утга (±SE)-ийг дээрх графикаас харж болно.
Хэлэлцүүлэг: Энэ судалгаагаар бид ходоодны хавдрын BGC803 эсийн миграцын процесст лизофосфатидын хүчил (LPA)-ийн нөлөө болон тэдгээрийн рецепторуудын экспресс хоорондын хамааралыг судалсан. Лизофосфатидын хүчил (LPA) нь LPAR 1-3 рецепторуудын оролцоотойгоор эсийн хэт олшрол болон миграцын олон хэлбэр бүхий эсийн процессуудад оролцдог байна [4,10]. Лизофосфатидын хүчил (LPA)- ээр идэвхиждэг рецепторууд pertussis toxin (PTX) -д мэдрэг Gi/o гетеротример хэлбэрийн уургийг голлон идэвхижүүлдэг. Ингэснээр N-Ras small GTP-aза , Rac болон RhoA зэрэг эсийн сигналын замууд идэвхижинэ [8]. Бидний туршилтын BGC803 эсийн рецепторуу д (LPARs)-ын экспрессын үр дүнгээс харахад BGC803 эсэд LPAR3 рецептор илүү үүрэгтэй болох нь харагдсан. Өмнөх судалгааны материалаас харахад ходоодны хавдрын 8 төрлийн эсүүд дээр Northern blot анализаар LPAR1, LPAR2 болон LPAR3 рецепторуудын м РНХ-ийн экпрессыг судалсан дүнгээр ходоодны хавдрын төрөл бүрийн эсүүд дээрхи LPAR1, LPAR2 болон LPAR3 рецепторуудын хэмжээ харилцан адилгүй байдлаар илэрчээ [3,14]. Бидний цаашдын туршилтад si РНХ ( small interfering RNA)- г ашиглан, LPAR2 болон LPAR3 рецепторуудын генийг дарангуйлан судлах шаардлага тавигдаж байна. Бид туршилтаараа ходоодны хавдрын BGC803 эсийн миграцид LPAR3 рецептор гол үүрэгтэй болохыг тогтоов .
Дүгнэлт: Бид LPA- өдөөгдсөн эсийн миграцид оролцож байгаа рецепторыг тогтоохын тулд LPAR1 болон LPAR3 рецепторуу дын антогонист болох Ki16425- ийг ашигласан. Бид LPA-өдөөгдсөн эсийн миграцыг Ki16425 бууруулж байгааг тогтоосон . LPA-өдөөгдсөн BGC803 эсийн миграцид G уург ийн аль хэлбэр оролцож байгааг тогтоохын тулд Gq уургийн ингибитор YM-254890, Gi уург ийн ингибитор pertussis toxin (PTX)-ыг эсийн миграцын туршилтад хэрэглэсэн. Туршилтын үр дүнгээс үзэхэд pertussis toxin (PTX) болон YM-254890 ингибиторуу д LPA-өдөөгдсөн эсийн миграцыг бууруулж байсан. Realtime PCR анализаар BGC803 эсийн LPAR1, LPAR2 болон LPAR3 рецепторуу дын экспрессыг судалж үзсэн. Эдгээр рецепторуу дээс BGC803 эсэд LPAR3 давамгай экспресслэгдэж буйг олсон . Энэ үр дүн нь LPA-өдөөгдсөн BGC803 эсийн миграцид LPAR3 рецептор гол үүрэгтэйг харуулсан. Эцэст нь хэлэхэд LPAR рецепторуудын антогонист нэгдлүүдийн судалгаа нь ходоодны хавдрын эмчилгээ болон урьдчилан сэргийлэлтэнд түлхэц болох судалгааны ирээдүйтэй чиглэл юм .
2. Dai Shida, Joji Kitayama, Hironori Yamaguchi, Yurai Okaji, Nelson Hirokazu Tsuno, Toshiaki Watanabe, Yoh Takuwa, and Hirokazu Nagawa: Lysophosphatidic Acid (LPA) Enhances the Metastatic Potential of Human Colon Carcinoma DLD1 cells through LPA1. 2003, Cancer Research 63, 1706-1711.
3. Dai Shida, Joji Kitayama, Hironori Yamaguchi, Kotaro Hama, Junken Aoki, Hiroyuki Arai, Hirohary Yamashita, Ken Mori, Akihiro Sako, Tsuyoshi Konishi, Toshiaki Watanabe, Teruyuki Sakai, Rika Suzuki, Hideo Ohta, Yoh Takuwa, Hirokazu Nagawa: Dual mode regulation of migration by lysophosphatidic acid in human gastric cancer cells. 2004, Science, Experimental Cell Research 301 168-178.
4. D Murray, G Horgan, P MacMathuna and P Doran: NET1-mediated RhoA activation facilitates lysophosphatidic acid-induced cell migration and invasion in gastric cancer. 2008, British Journal of Cancer 99, 1322-1329.
5. James J.A. Contos, Isao Ishii, and Jerold Chun: Lysophosphatidic Acid Receptors. 2000,Mol. Pharmacol 58:1188-1196.
6. Junken Aoki, Akitsu Taira, Yasukazu Takanezawa, Yasuhiro Kishi, Kotaro Hama, Tatsuya Kishimoto, Koji Mizuno, Keijiro Saku, Ryo Taguchi and Hiroyuki Arai: Serum Lysophosphatidic Acid Is Produced through Diverse Phospholipase Pathways. 2002, J.Biol.Chem.277:48737-48744.
7. Kyoko Noguchi, Deron Herr, Tetsuji Mutoh and Jerold Chun: Lysophosphatidic acid (LPA) and its receptors. 2009, Pharmacol 9:15-23.
8. Martina Stahle, Christine Veit, Ulla Bachfischer, Karina Schierling, Bettina Skripczynski, Alan Hall, Peter Gierschik and Klaudia Giehl: Mechanisms in LPAinduced tumor cell migration: critical role of phosphorylated ERK. 2003, Journal of Cell Science 116, 3835-3846.
9. Mayumi Komachi, Hideaki Tomura , Enkhzol Malchinkhuu, Masayuki Tobo, Chihiro Moga ,Takayuki Yamada, Takao Kimura, Atsushi Kuwabara,Hideo Ohta,Doon-
Soon Im, Hitoshi Kurose, Izumi Takeyoshi, Koichi Sato and Fumikazu Okajima: LPA1 receptors mediate stimulation, whereas LPA2 receptors mediate inhibition, of migration of pancreatic cancer cells in response to lysophosphatidic acid and malignant ascites. 2009, Carcinogenesis vol.30 no.3pp.457-465.
10. Subramaniam Ramachandran, Dai Shida, Masayuki Nagahashi, Xiajun Fang, Sheldon Milstien, Kazuaki Takabe, Sarah Spiegel: Lysophosphatidic acid stimulates gastric cancer cell proliferation via ERK1- dependent upregulation of sphingosine kinase 1 transcription. 2010, FEBS Letters 584 4077-4082.
